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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】糖蛋白SDS-PAGE后跑不出条带，这是为什么啊？---继续求助！急！
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cornerqian

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】糖蛋白SDS-PAGE后跑不出条带，这是为什么啊？---继续求助！急！

我的糖蛋白分子量在200kd左右，SDS-PAGE分离胶用的是8%的，可是总是跑不出东西，（不同方法提取的糖蛋白）有的样品跑完之后没有任何东西， 有的整个泳道内都是蓝色，就是没有条带，这是为什么呢？上样buffer用的是2×的，缓冲液都重新配过了也不行。另外，染色液有点配浅了，不知道有没有影响。请大家给予帮助。非常感谢！
之后又用5%和6%的胶跑，还是没有东西，8%和10%的跑过之后还是整个泳道内都是蓝色，高碘酸-希夫试剂（PAS）染色也不见有糖蛋白条带，到底是怎么回事啊？是样品中盐的影响吗？再过分子筛纯化糖蛋白会好点吗？急需大家帮助！万分感谢！

[ Last edited by cornerqian on 2009-12-19 at 22:11 ]
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1楼 2009-12-06 20:50:16
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xuezhen

银虫 (小有名气)
★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 12-7 20:27
跑胶之前是不是需要把蛋白样品变性一下，有跑marker嘛？有带嘛？是否需要配两种胶，浓缩胶加分离胶或许有效果点。
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2楼2009-12-06 21:50:35
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cornerqian

木虫 (小有名气)
蛋白变性了，有marker，而且有条带，浓缩胶6%的，分离胶8%，除了marker我的样品都跑不出来，可能分子量太大了，结构也复杂，所以难跑。不知道有没有更好的解决办法，或者是不是糖蛋白不太适合用SDS-PAGE啊？
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3楼2009-12-06 22:58:49
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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amisking(金币+3,VIP+0): 12-7 20:27
会不会是你的蛋白浓度比较低呢，增加你的蛋白的量吧，你的maker是正常的话，那么可能是你的蛋白量比较低。延长下你的电泳时间。
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4楼2009-12-07 10:45:51
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sxc_lover

铜虫 (小有名气)

百分之八的非变性胶跑8个小时

★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 12-7 20:27
用百分之八的非变性胶跑8个小时试一试,记得点MARKER ,你的分子量太大,你跑的是大板的吗?
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新手上路 多多指教
5楼2009-12-07 12:51:37
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cornerqian

木虫 (小有名气)
我用的是小板的，非变性胶跑8h的话，电压要调多少才能在8h内跑完呢？（我用的是稳压，浓缩胶80v，分离胶160v）对了，我们用的电极缓冲液是：tris 3g;甘氨酸 14.4g;SDS 0.5g,定容到100ml,用时在稀释10倍。我看网上有定容到500ml的，这个有影响吗？其实我是想要糖蛋白的蛋白部分，可是糖蛋白没跑出来，不敢用酶切蛋白后跑电泳，酶太贵了，要是切完跑还是这样更郁闷了。
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6楼2009-12-07 15:18:20
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cornerqian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sxc_lover at 2009-12-7 12:51:
用百分之八的非变性胶跑8个小时试一试,记得点MARKER ,你的分子量太大,你跑的是大板的吗?

我用的是小板的，非变性胶跑8h的话，电压要调多少才能在8h内跑完呢？（我用的是稳压，浓缩胶80v，分离胶160v）对了，我们用的电极缓冲液是：tris 3g;甘氨酸 14.4g;SDS 0.5g,定容到100ml,用时在稀释10倍。我看网上有定容到500ml的，这个有影响吗？其实我是想要糖蛋白的蛋白部分，可是糖蛋白没跑出来，不敢用酶切蛋白后跑电泳，酶太贵了，要是切完跑还是这样更郁闷了。
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7楼2009-12-07 20:17:56
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
浓缩胶6%浓度太高了。
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8楼2009-12-08 08:42:08
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qiang84zhang

银虫 (正式写手)
你的蛋白的分子量太大了，你的MARKER是多大的？
只能把胶的浓度再降些！否则，蛋白根本就跑不动，200，太大了！
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9楼2009-12-08 09:23:41
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烟大考研

金虫 (正式写手)
★
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我们的也是糖蛋白，分子量在80kd左右，用的浓缩胶5%，分离胶12%，楼主的用8%的胶跑200kd的应该没有问题，出现泳道内全是蓝色的情况是你的蛋白发生了降解，或者蛋白抽提的不纯，建议楼主将你们提取的蛋白过一下分子筛，然后再浓缩一下，用上样Buffer稀释到0.5mg/ml上样20ul
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心信其可行，则移山填海之难，终有成功之日；心信其不可行，则反掌折枝之易，亦无收效之期
10楼2009-12-08 09:32:29
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