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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[交流] 请教各位大侠有关PCR的问题

为什么我的基因(约2kb)PCR用EasyTaq酶(Transgen公司)能扩增出来,而用pfu酶却无法扩增,换了个公司的pfu酶也不行,不知道是哪里出问题了,请各位帮忙?

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-27 at 13:27 ]
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09021122

木虫 (正式写手)

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1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 11-26 18:25
长度在2KB左右,一般用高保真的酶是可以扩出来的,除非有以下几点原因:
1:操作上的不规范。如果操作不是很细心的话,很容易扩不出来。
2:酶的失活。如果你的taq酶本身就是失效的,根本就扩不出来。
3:用pfu酶时,退火温度是否有变化呢?如果对退火温度要求有变化的话,而你又没有调的话,也是扩不出来的。
4:应该是原材料的保证。如果全基因组有问题的话,当然是扩不出来的。
雄关漫道真如铁,而今迈步从头越
2楼2009-11-26 13:39:41
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 09021122 at 2009-11-26 13:39:
长度在2KB左右,一般用高保真的酶是可以扩出来的,除非有以下几点原因:
1:操作上的不规范。如果操作不是很细心的话,很容易扩不出来。
2:酶的失活。如果你的taq酶本身就是失效的,根本就扩不出来。
3:用pf ...

因为用Taq酶就能扩出来,应该不是操作或是基因组的问题,而且pfu酶又是买的新的,Takara的,酶应该不会失活。我也做梯度了,就是没有扩出来,找不到原因。
3楼2009-11-26 14:10:08
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

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1949stone(金币+1,VIP+0):有道理 11-26 18:25
也有可能 是基因组空间构型的问题吧!高保真的酶比起Taq来更难以结合些。
4楼2009-11-26 15:44:02
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liyong1981

金虫 (正式写手)


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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢 11-26 18:26
从不用高保真的人飘过~建议,你的就2K,不需要用高保真的酶。MBI的Taq扩的应该没一点问题,或者你按步骤再从新做一遍,注意:高保真酶要求比较严格,请按宝生物说明书来~
5楼2009-11-26 15:52:44
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六妖妖

金虫 (正式写手)


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pru酶的退火温度一般会比普通tag酶高2-5度。估计是没有筛选好退火温度。
6楼2009-11-26 23:37:26
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)


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EasyTaq酶(Transgen公司)我们现在也在用,我们师兄前几天和 宝生物,天根的做了个对比。它的扩增效率确实高.但是他的BUFFER也存在问题,跑PAGE总是有一条带,挡住了自己的片段,对于读带很有影响,公司给我们重新做的Buffer,我们还没收到,不知道效果如何。现在我们也只有用宝生物的rtaq
7楼2009-11-27 09:29:27
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)


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pfu酶的延伸速度比较慢!大约只有600bp每分钟,而一般的taq酶可以达到1000bp,
你要是用高保真酶做PCR,延伸时间应该增加一倍!
一个人可以不成功,但不可以不成长!
8楼2009-11-27 09:32:32
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yunaitong

木虫 (小有名气)


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EasyTaq酶(Transgen公司)本身有一条带
他是酒精或其他什么东西
你在凝胶成像系统看看,他是红色的带
不是你的目的带~~~
所以其他酶没扩出来正常
9楼2009-11-27 10:01:09
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