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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教各位大侠有关PCR的问题
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[交流] 请教各位大侠有关PCR的问题

为什么我的基因(约2kb)PCR用EasyTaq酶(Transgen公司)能扩增出来，而用pfu酶却无法扩增，换了个公司的pfu酶也不行，不知道是哪里出问题了，请各位帮忙？

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-27 at 13:27 ]
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1楼 2009-11-26 09:46:03
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09021122

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+3,VIP+0):谢谢交流 11-26 18:25
长度在2KB左右，一般用高保真的酶是可以扩出来的，除非有以下几点原因：
1：操作上的不规范。如果操作不是很细心的话，很容易扩不出来。
2：酶的失活。如果你的taq酶本身就是失效的，根本就扩不出来。
3：用pfu酶时，退火温度是否有变化呢？如果对退火温度要求有变化的话，而你又没有调的话，也是扩不出来的。
4：应该是原材料的保证。如果全基因组有问题的话，当然是扩不出来的。
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雄关漫道真如铁，而今迈步从头越
2楼2009-11-26 13:39:41
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huangqihong

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 09021122 at 2009-11-26 13:39:
长度在2KB左右，一般用高保真的酶是可以扩出来的，除非有以下几点原因：
1：操作上的不规范。如果操作不是很细心的话，很容易扩不出来。
2：酶的失活。如果你的taq酶本身就是失效的，根本就扩不出来。
3：用pf ...

因为用Taq酶就能扩出来，应该不是操作或是基因组的问题，而且pfu酶又是买的新的，Takara的，酶应该不会失活。我也做梯度了，就是没有扩出来，找不到原因。
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3楼2009-11-26 14:10:08
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
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1949stone(金币+1,VIP+0):有道理 11-26 18:25
也有可能 是基因组空间构型的问题吧！高保真的酶比起Taq来更难以结合些。
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4楼2009-11-26 15:44:02
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liyong1981

金虫 (正式写手)
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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢 11-26 18:26
从不用高保真的人飘过~建议，你的就2K，不需要用高保真的酶。MBI的Taq扩的应该没一点问题，或者你按步骤再从新做一遍，注意：高保真酶要求比较严格，请按宝生物说明书来~
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5楼2009-11-26 15:52:44
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六妖妖

金虫 (正式写手)
★
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pru酶的退火温度一般会比普通tag酶高2-5度。估计是没有筛选好退火温度。
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6楼2009-11-26 23:37:26
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★
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EasyTaq酶(Transgen公司)我们现在也在用，我们师兄前几天和 宝生物，天根的做了个对比。它的扩增效率确实高.但是他的BUFFER也存在问题，跑PAGE总是有一条带，挡住了自己的片段，对于读带很有影响，公司给我们重新做的Buffer，我们还没收到，不知道效果如何。现在我们也只有用宝生物的rtaq
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7楼2009-11-27 09:29:27
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
★
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pfu酶的延伸速度比较慢！大约只有600bp每分钟，而一般的taq酶可以达到1000bp，
你要是用高保真酶做PCR，延伸时间应该增加一倍！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
8楼2009-11-27 09:32:32
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yunaitong

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
EasyTaq酶(Transgen公司)本身有一条带
他是酒精或其他什么东西
你在凝胶成像系统看看，他是红色的带
不是你的目的带~~~
所以其他酶没扩出来正常
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9楼2009-11-27 10:01:09
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