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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教DNA互补单链如何实现杂交
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hunter82417

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 请教DNA互补单链如何实现杂交

让DNA互补单链实现杂交，
离子强度和溶液PH有何要求？仅加入钠盐可以吗？
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1楼 2009-11-23 21:08:22
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
hunter82417(金币+2,VIP+0): 11-23 22:12
amisking(金币+1,VIP+0): 11-24 16:49
理论上在水中都可以，分子碰撞。不过一般还是有杂交缓冲液或者退火缓冲液的，离子和ph对于杂交的效率以及特异性有影响。
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2楼2009-11-23 21:27:23
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
hunter82417(金币+1,VIP+0): 11-24 16:47
amisking(金币+2,VIP+0): 11-24 16:50
这个也太简单了。

（1）把DNA 单链溶解于 10mM Tris, 1mM EDTA, 50 mM NaCl (pH=8.0) 溶液中。
（2）1：1混合两条互补单链。
（3）95度加热5min， 然后放到常温下，让它自然冷却，等完全冷却到室温，就可以形成互补双链了。
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3楼2009-11-24 15:11:03
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qingfengwu

金虫 (小有名气)
不是二楼说的那样的，please。
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4楼2009-11-24 15:11:46
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hunter82417

铁杆木虫 (著名写手)
要加热95？
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5楼2009-11-24 16:48:14
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0): 11-24 18:25
hunter82417(金币+1,VIP+0): 11-24 21:46
二楼说的是正确的，在水中，一定浓度DNA本身就可以通过升降温处理来形成双链，氢键引导的。
当然，离子强度和pH的影响不可忽视。若离子强度太高，不难想象整个氢键网络会出现什么变化。
若是懒得配试剂，可以在TE中先94~95℃变性几分钟，然后再缓慢降温
现在天气冷，不要直接放室温，这样降温速度太快容易造成非预期的杂交
退火buffer其实也就是TE中加了NaCl去调盐强度，这个网上一搜到处都有，遇见不同离子强度的配方也不要感到惊奇，其实效果差不多，这些都是可以容忍的范围

可以参考这个产品的使用说明，反正我用着挺好
http://www.beyotime.com/annealing-buf-dna.htm
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6楼2009-11-24 18:22:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
加热的原因是为了充分打开oligo自身形成的二级结构，然后缓慢降温的意义是为了提高杂交特异性
想象另外一个极端，如果骤冷（比如SSCP的处理方法），那么oligo都来不及和对方互补就自身形成了二级结构了
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7楼2009-11-24 18:23:23
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★
hunter82417(金币+1,VIP+0): 11-24 21:47
引用回帖:
Originally posted by qingfengwu at 2009-11-24 15:11:
不是二楼说的那样的，please。

楼主也没说具体在什么情况下杂交啊！如果是芯片杂交，一般是不加热的。如果是液相，能加热到95度当然最好，要根据实际情况考虑吧。
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8楼2009-11-24 21:24:47
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hunter82417

铁杆木虫 (著名写手)
感谢指导
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9楼2009-11-24 21:48:12
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