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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关构建质粒的一些问题
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LIU0118

[交流] 关构建质粒的一些问题

总是不能构建成功，连接完进行转化涂板都会长出很多的菌落，酶切鉴定无正确的，大多是载体自成环，请教一下应从哪些步骤来解决，请大侠多多帮忙~
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1楼 2009-11-19 10:37:28
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:27
self ligation的话就dephosphoralation
一般如果不是同一个酶切位点的话 多挑几个还是能挑出来的
挑不出来直接处理vector 脱磷酸后怎么它也自己连不起来了
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2楼2009-11-19 10:46:06
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grief

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:27
载体的酶切要保证完全，按照说明书上适当的扩大酶切体系和酶的用量，注意酶量不能超过体系的1/10。如果切下来的片段大的话，做个电泳，纯化回收。
连接的时候做阴性对照，如果对照平板上菌落太多，分析清楚原因在做，这样会好些的。
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等待秋天
3楼2009-11-19 11:14:57
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message

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用去磷酸化酶可以减少很多工作，换个好点的酶。
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4楼2009-11-19 15:45:01
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solopen

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你加的质粒量可能过大了
把目的片段和质粒的比关系调一调
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5楼2009-11-19 16:51:35
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caoliang38

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
建议楼主把详细细节写清楚 否则回帖只能是按照自己的经验回复 而不是针对楼主的 谢谢
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6楼2009-11-19 19:48:48
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漫迹

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我正准备做双酶切连接，构建载体呢，一同学习中，嘿嘿
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7楼2009-11-19 20:50:15
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
补充一下 我用toyobo的ligation high v2
然后摩尔比3/1
一般都没问题
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8楼2009-11-20 09:47:44
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Jack_dong

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by heismeng at 2009-11-20 09:47:
补充一下 我用toyobo的ligation high v2
然后摩尔比3/1
一般都没问题

toyobo?  好像不怎么好用吧？

呵呵呵，个人观点
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9楼2009-11-20 10:19:26
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foreverjohn

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
总结一下：载体去磷，使用双没切，加大片段的量，作对照等！更重要的时候如果阳性克隆比较少，可以先菌落PCR找阳性克隆，再进行验证
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10楼2009-11-20 13:17:00
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