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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切啊，越切越没有
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小白3521

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切啊，越切越没有

郁闷死了，这段时间做双酶切，最开始用的是takara的酶切的，我嫌切的久而且不亮，听说用fermentas的酶好，就换这个牌子的酶，结果这个酶反而切不下来，而且我现在用takara酶切，按照以前能够切出来的体系也切不出来了，很奇怪。会不会有种可能，是片段从质粒里丢失了？
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1楼 2009-11-19 10:25:20
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heismeng

金虫 (小有名气)
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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:26
多做些量吧 25做不出来的时候我都做100的体系
然后BSA加上 两个酶的比例再调一下
片段一般不会从质粒中丢失的 我好几个月的都继续切也没问题
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2楼2009-11-19 10:43:19
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grief

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:26
你切下来的片段是多少个碱基？碱基的数目和其亮度是成正比的。如果碱基少，酶切量又少，不亮是很正常的。
一般我们双酶切用的都是fermentas的酶，质粒大约1ug就可以了！
菌种最好保持其抗性压力，如果你不确定基因片段是否还在载体中，最好做个PCR鉴定下。
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等待秋天
3楼2009-11-19 10:52:11
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小白3521

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by grief at 2009-11-19 10:52:
你切下来的片段是多少个碱基？碱基的数目和其亮度是成正比的。如果碱基少，酶切量又少，不亮是很正常的。
一般我们双酶切用的都是fermentas的酶，质粒大约1ug就可以了！
菌种最好保持其抗性压力，如果你不确定基 ...

我的片段是400多的，我觉得我提的质粒就不是很亮，也不知道什么原因，用的试剂盒提的
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4楼2009-11-19 11:07:49
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grief

铜虫 (初入文坛)
★ ★
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1949stone(金币+1,VIP+0):很热情 11-19 17:26
如果你的菌不是低拷贝，那么就是试剂盒回收效率的问题了。
我们实验室提取质粒也是用试剂盒。一般我们摇菌时抗性的浓度会稍微多加点，在抗性的压力下，如果过夜摇菌的话，菌中的质粒就不会减少太多。一般是提取3-6ML菌液，加入2号试剂总时间不超过5min，洗脱的超纯水65度。
最后你洗脱完了，可以用移液器把溶液再转入柱子中，再离心洗脱一次，这样回收效率会高点。
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等待秋天
5楼2009-11-19 15:27:38
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solopen

铜虫 (初入文坛)
★
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多提两次质粒，加到一起浓缩（70%乙醇）
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6楼2009-11-19 16:59:26
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~明晓溪~

木虫 (正式写手)
学点经验，
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7楼2009-11-19 17:03:36
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yzhang1986

铁杆木虫 (文坛精英)

优秀版主
酶切很不好做吗
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8楼2009-11-19 18:38:49
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漫迹

金虫 (小有名气)
★
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做酶切就相当于质粒被稀释了，不亮也正常吧，我也准备做这个，一同学习
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9楼2009-11-19 21:11:46
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漫迹

金虫 (小有名气)
做酶切就相当于质粒被稀释了，不亮也正常吧，我也准备做这个，一同学习
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10楼2009-11-19 21:12:25
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