24小时热门版块排行榜    

查看: 984  |  回复: 12
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

小白3521

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切啊,越切越没有

郁闷死了,这段时间做双酶切,最开始用的是takara的酶切的,我嫌切的久而且不亮,听说用fermentas的酶好,就换这个牌子的酶,结果这个酶反而切不下来,而且我现在用takara酶切,按照以前能够切出来的体系也切不出来了,很奇怪。会不会有种可能,是片段从质粒里丢失了?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小白3521

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by grief at 2009-11-19 10:52:
你切下来的片段是多少个碱基?碱基的数目和其亮度是成正比的。如果碱基少,酶切量又少,不亮是很正常的。
一般我们双酶切用的都是fermentas的酶,质粒大约1ug就可以了!
菌种最好保持其抗性压力,如果你不确定基 ...

我的片段是400多的,我觉得我提的质粒就不是很亮,也不知道什么原因,用的试剂盒提的
4楼2009-11-19 11:07:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

heismeng

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:26
多做些量吧 25做不出来的时候我都做100的体系
然后BSA加上 两个酶的比例再调一下
片段一般不会从质粒中丢失的 我好几个月的都继续切也没问题
2楼2009-11-19 10:43:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

grief

铜虫 (初入文坛)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 11-19 17:26
你切下来的片段是多少个碱基?碱基的数目和其亮度是成正比的。如果碱基少,酶切量又少,不亮是很正常的。
一般我们双酶切用的都是fermentas的酶,质粒大约1ug就可以了!
菌种最好保持其抗性压力,如果你不确定基因片段是否还在载体中,最好做个PCR鉴定下。
等待秋天
3楼2009-11-19 10:52:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

grief

铜虫 (初入文坛)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+1,VIP+0):很热情 11-19 17:26
如果你的菌不是低拷贝,那么就是试剂盒回收效率的问题了。
我们实验室提取质粒也是用试剂盒。一般我们摇菌时抗性的浓度会稍微多加点,在抗性的压力下,如果过夜摇菌的话,菌中的质粒就不会减少太多。一般是提取3-6ML菌液,加入2号试剂总时间不超过5min,洗脱的超纯水65度。
最后你洗脱完了,可以用移液器把溶液再转入柱子中,再离心洗脱一次,这样回收效率会高点。
等待秋天
5楼2009-11-19 15:27:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 澳大利亚 Murdoch University 全奖博士招生(3个名额)地质化工冶金领域 +47 AI8RaGaPaSCR 2026-08-07 50/2500 2026-08-14 02:15 by QhTuz5gvDira
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 12/600 2026-08-13 23:20 by iwuli
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +3 启萌科技 2026-08-12 11/550 2026-08-13 22:57 by 启萌科技
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +9 Tide man 2026-08-10 10/500 2026-08-13 20:33 by 温淼淼淼
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] 有时候,自然基金真的不能太认真 (我的申报经验) +4 majunge000 2026-08-11 6/300 2026-08-13 16:50 by 四季常青藤
[基金申请] filecode +14 documentary 2026-08-10 16/800 2026-08-13 16:39 by 润生71
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +7 布布和一二 2026-08-10 10/500 2026-08-12 09:12 by 布布和一二
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制,评价高的钱多评价低的钱少,但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变,有变的大神么? +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
请填处理意见