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夏末～易科

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[交流] CCK8实验注意事项

CCK8实验注意事项
一、试剂使用与保存
1. 避光保存：试剂需在-20℃避光保存，避免反复冻融；使用前需平衡至室温以维持活性。
2. 防污染操作：移液需使用无菌枪头，避免微生物污染导致试剂失效。
二、细胞处理要点
1. 细胞密度优化：贴壁细胞建议每孔接种500-10000个（毒性实验需更高密度，增殖实验可适当降低）。
预实验确定最佳细胞量，避免过密（营养耗尽导致假阴性）或过稀（信号弱）。
2. 均匀铺板：细胞悬液需充分混匀，接种时每加5孔后吹打一次防止沉淀。
边缘孔加入PBS或培养基以减少蒸发干扰。
3. 预培养稳定：贴壁细胞需预培养2-6小时后再加试剂，悬浮细胞可直接实验8。
三、实验操作规范
1. 试剂添加：每孔加10μL CCK8溶液，避免产生气泡（可调节移液器档位至“吸二档打一档”）若培养基体积变化（如原体积200μL），需按比例调整CCK8用量
2. 孵育时间控制：常规孵育1-4小时，每隔2小时检测吸光度，OD值控制在1.0左右为宜。显色不足或过久均影响结果准确性。
四、干扰因素排除
1. 背景干扰处理：含酚红培养基或高浓度血清需设置空白对照（培养基+CCK8，无细胞）。有色药物需提前检测吸光度干扰，必要时换液后再加CCK8。
2. 数据校正：计算细胞存活率或抑制率时，需扣除空白孔吸光度（公式：存活率=As?AbAs?Ab/Ac?AbAc?Ab×100%）。
五、其他关键细节
1. 复孔设置：每组设置4-6个复孔，药物浓度梯度需3个复孔取均值。
2. 仪器校准：酶标仪检测波长建议450nm，双波长检测可选参考波长600-650nm。
总结：CCK8实验需严格把控细胞密度、试剂活性及操作规范，通过预实验优化条件，并合理设置对照以排除干扰，确保数据可靠性。

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1楼 2025-04-22 10:33:48

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