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yoyoyehan

[交流] 双酶切的反应体系和时间

各位虫友有做过XbaI和XhoI双酶切的么?
我用这两个酶切  反应体系  XbaI  1ul,
                                          XhoI   1ul,
                                        10  M   2ul,
                                           质粒  5ul,
                                       ddH2O  11ul
                           37度  6小时,但是酶切后效果不好,请问大家的反应体系和反应条件是怎么样的呀?
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
如果是TaKaRa的酶,将酶切体系扩大一倍试试。
Thank-you,so-blue.
2楼2009-11-04 09:41:29
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xiaoai8039

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
关键问题是:你的质粒浓度是不是太高或太低了???
检测一下浓度是多大,从而来确定酶的用量,一般酶的用量要稍大些。
3楼2009-11-04 10:22:19
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小小豆豆

金虫 (小有名气)


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先检测一下质粒浓度,在确定酶得用量
4楼2009-11-04 10:27:31
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黑罕

金虫 (小有名气)

分步酶切
5楼2009-11-04 12:38:52
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银杏下

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
得看你是哪个公司的酶,比如NEB的是可以同时酶切,而fermentas的是不可以的。另外你这个体系我认为是酶加多了,一般XhoI 50uL体系加1uL就可以了,你20uL就加了1uL,根据我的经验,酶加多了反而是切割不能完全。
6楼2009-11-04 14:33:24
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yoyoyehan

引用回帖:
Originally posted by 银杏下 at 2009-11-4 14:33:
得看你是哪个公司的酶,比如NEB的是可以同时酶切,而fermentas的是不可以的。另外你这个体系我认为是酶加多了,一般XhoI 50uL体系加1uL就可以了,你20uL就加了1uL,根据我的经验,酶加多了反而是切割不能完全。

我用的是TaKaRa的酶,请问你用的是这个么?
7楼2009-11-04 14:56:24
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宛辰

木虫 (小有名气)


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我们用的是takala的,但是我们只酶切3个小时,没切过那么久,你可以试试把时间减少点,再有就是你的质粒不要太多,要是质粒很浓的话,加那么多,体系还小,容易切得效果不好!
8楼2009-11-04 15:21:56
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小白3521

金虫 (小有名气)


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我最近也在做双酶切,用的takara的,试过很多体系,结果不是很理想
再不行,我就换fermentas的酶,听说很好
9楼2009-11-04 22:20:46
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)

★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0): 11-10 11:37
TAKARA的酶虽然说 3~5u可以 切1ugDNA,但是我认为10U才能切1ug的。
你按照 10u切 1ug 试试,而且每种酶切它的 单位体积的u单位也不一样。
ps:3h之后酶几乎没什么活力了。
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
10楼2009-11-10 11:04:30
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