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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 构建新质粒载体
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seeker91

木虫 (文坛精英)

[交流] 构建新质粒载体

基于蓝白斑筛选载体PUC57构建一种新的载体，此载体在LacZ的下游融合进一个致死基因CCDB，此基因在大肠杆菌内表达后会产生CCDB蛋白，此蛋白能灭活DNA旋转酶，从而导致宿主的死亡，因此，凡是有外源基因插入的载体宿主存活，没有外源基因片段插入的载体宿主死亡，即只要宿主存活，就说明载体连入了外源基因，简化了蓝白斑筛选。
本人从文献上得知这一原理，也进行过实验，但实验结果令人百思不得其解，发现存活的个体也有未插入片段的载体，或者载体本身在转换过程中被破坏。现请教广大虫友，不吝赐教，出谋划策，援手相助！
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1楼 2009-10-26 12:27:50
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 10-26 19:08
个人认为关键在于融合进的致死基因CCDB是否在大肠杆菌里面表达了。如果转进改基因，大肠杆菌不表达，就没取到筛选的作用了。
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Thank-you，so-blue.
2楼2009-10-26 12:50:40
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seeker91

木虫 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-10-26 12:50:
个人认为关键在于融合进的致死基因CCDB是否在大肠杆菌里面表达了。如果转进改基因，大肠杆菌不表达，就没取到筛选的作用了。

可以考虑！！
请继续发言！！
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3楼2009-10-26 13:11:32
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zier1011

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3,VIP+0): 10-26 19:09
1.致死基因连进去后，重组质粒转化大肠杆菌怎么生长？他不是让宿主致死了吗？
2.如果你是提取空的质粒后，先连接了CCDB，然后有连接了其他的目的片段，最后再做转化，你怎么就能保证你的CCBD就一定正确连接了呢？难道要把两段基因都连接之后测序？
3.如果你只是看了连接后的片段长度，那并不能说明CCBD连接进去就一定有活性的，我们平常在做克隆表达时，不是很多时候都没有活性的吗，要挑很多转化子，才有可能找到有表达的重组子，而且未必有活性！
4.因此说，凭什么说连接进去的CCBD就一定能表达并且有活性呢？
5.或者有其他的方法保证连接正确和表达成功并肯定有活性？等回答
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花还香香的
4楼2009-10-26 15:07:42
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by zier1011 at 2009-10-26 15:07:
1.致死基因连进去后，重组质粒转化大肠杆菌怎么生长？他不是让宿主致死了吗？
2.如果你是提取空的质粒后，先连接了CCDB，然后有连接了其他的目的片段，最后再做转化，你怎么就能保证你的CCBD就一定正确连接了呢？ ...

你都没有理解楼主说的什么意思，就提出一堆问题
问题1：
楼主并不是要克隆CCDB致死基因，而是将CCDB 作为反向选择标志，CCDB融合在LacZ下游，当没有外源片段插入时可以跟LacZ融合表达，如果没有CCDB基因，长出来的菌落表现为蓝色，这是传统的蓝白斑筛选，现在在其下游融合CCDB致死基因，没有外源基因插入是，直接致死菌，提高筛选效率。
问题2：
楼主的CCDB基因是预先构建在载体上，怎么就不能保证正确连接呢，如果不是正确连接的，拿他来做实验还有什么意义啊。

[ Last edited by gyesang on 2009-10-26 at 17:11 ]
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5楼2009-10-26 16:56:23
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seeker91

木虫 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by zier1011 at 2009-10-26 15:07:
1.致死基因连进去后，重组质粒转化大肠杆菌怎么生长？他不是让宿主致死了吗？
2.如果你是提取空的质粒后，先连接了CCDB，然后有连接了其他的目的片段，最后再做转化，你怎么就能保证你的CCBD就一定正确连接了呢？ ...

ccdb 只在宿主大肠杆菌内能表现出致死这一特性，在其它宿主如DB3.1内是不表现致死特性的。因此可以再DB3.1内获得重组质粒。
构建这一载体，只需在原有PUC57的基础上插入CCDB基因便可，只要LacZ表达，ccdb就能表达，因此按理说来，ccdb是可以表达的。但实验结果有些难以验证这样的理论！纳闷！！
不好意思，忙晕了头，回的晚了！！！
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6楼2009-10-26 16:58:24
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gyesang

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★
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不过不知道为什么有CCDB基因存在，还能长出空载体出来，这个问题还有待证实，我用的T-blunt一种T载体上，也是带有CCDB基因的，但总是有空载体长出来，不过我没有进空载体送去测序一探究竟，毕竟不是专门做这个东西的，最后筛选到我的阳性克隆也就行了，希楼主能把问题搞清楚，然后为大家解惑啊
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7楼2009-10-26 17:15:26
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seeker91

木虫 (文坛精英)
对了，我这个新质粒已经完全测通了，序列完全正确！！
4楼兄弟说的两个问题很对！
就是在使用的过程中，别的基因片段有时只连进去几个碱基，有时一个也连不上还把质粒本身给破坏了，要么坏几个碱基，要么坏一段碱基！
想不通呀！！！！！！！！！！！！！！！
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8楼2009-10-26 17:27:59
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zier1011

木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
Originally posted by gyesang at 2009-10-26 16:56:

你都没有理解楼主说的什么意思，就提出一堆问题
问题1：
楼主并不是要克隆CCDB致死基因，而是将CCDB 作为反向选择标志，CCDB融合在LacZ下游，当没有外源片段插入时可以跟LacZ融合表达，如果没有CCDB基因，长出 ...

1.我的疑问就是CCBD融合表达之后，怎么得到这个质粒的扩增，CCBD和lacz融合表达后有没有致死作用，有的话你怎么得到这个质粒的扩增？我的疑问在这里！
2.还是这呀，CCBD本来就构建在质粒里，那么这个质粒就会使宿主致死，所以没办法的到这个质粒的扩增呀。

你还是留给我同样的疑问啦，还好seeker回答了我的问题，谢谢啦！
DB3.1不是大肠杆菌吗？那是什么菌？我没做过致死基因选择，也没接触到这个菌株，劳烦回答下

[ Last edited by zier1011 on 2009-10-26 at 20:38 ]
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花还香香的
9楼2009-10-26 20:32:01
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zier1011

木虫 (著名写手)
★
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谢谢楼主，学习了，我的疑惑也终于解开了，
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花还香香的
10楼2009-10-26 20:41:34
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