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seeker91
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[交流]
构建新质粒载体
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基于蓝白斑筛选载体PUC57构建一种新的载体，此载体在LacZ的下游融合进一个致死基因CCDB，此基因在大肠杆菌内表达后会产生CCDB蛋白，此蛋白能灭活DNA旋转酶，从而导致宿主的死亡，因此，凡是有外源基因插入的载体宿主存活，没有外源基因片段插入的载体宿主死亡，即只要宿主存活，就说明载体连入了外源基因，简化了蓝白斑筛选。 本人从文献上得知这一原理，也进行过实验，但实验结果令人百思不得其解，发现存活的个体也有未插入片段的载体，或者载体本身在转换过程中被破坏。现请教广大虫友，不吝赐教，出谋划策，援手相助！ |
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seeker91 
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1.致死基因连进去后，重组质粒转化大肠杆菌怎么生长？他不是让宿主致死了吗？ 2.如果你是提取空的质粒后，先连接了CCDB，然后有连接了其他的目的片段，最后再做转化，你怎么就能保证你的CCBD就一定正确连接了呢？难道要把两段基因都连接之后测序？ 3.如果你只是看了连接后的片段长度，那并不能说明CCBD连接进去就一定有活性的，我们平常在做克隆表达时，不是很多时候都没有活性的吗，要挑很多转化子，才有可能找到有表达的重组子，而且未必有活性！ 4.因此说，凭什么说连接进去的CCBD就一定能表达并且有活性呢？ 5.或者有其他的方法保证连接正确和表达成功并肯定有活性？等回答 |
4楼2009-10-26 15:07:42
gyesang
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