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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

[求助] 用基因组p一个3k多的片段,一直p不出来,了已有2人参与

用的高保真酶,温度从58变到55度,延伸和退火的时间和温度一直在变,p不出来,快疯了,p了几个礼拜

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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

2楼2024-07-19 16:40:17
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

老是没有目的条带,应该在5000marker的第二个条带那里

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3楼2024-07-19 16:41:22
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AD_com

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
P不出来就换引物,前后多设计几对引物交叉组合使用,不要纠结于温度,温度上下差几度都没问题,再不行就去做基因合成
4楼2024-07-20 07:16:53
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by AD_com at 2024-07-20 07:16:53
P不出来就换引物,前后多设计几对引物交叉组合使用,不要纠结于温度,温度上下差几度都没问题,再不行就去做基因合成

那可以提高胶浓度嘛

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5楼2024-07-21 07:11:19
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AD_com

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by xzwlove at 2024-07-21 07:11:19
那可以提高胶浓度嘛
...

扩不出来就换引物,比摸索条件有意义,何况一件事情要是基础不好,再怎么掩饰都无济于事。
6楼2024-07-21 15:41:40
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御风(远)

新虫 (初入文坛)

PCR起到关键作用的是引物和酶(本质),其他优化都是治标不治本,赶紧看看引物设计的质量。或者换酶(MIX也行)
7楼2024-07-22 17:00:52
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by AD_com at 2024-07-21 15:41:40
扩不出来就换引物,比摸索条件有意义,何况一件事情要是基础不好,再怎么掩饰都无济于事。...

好吧谢谢

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8楼2024-07-23 18:43:58
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 御风(远) at 2024-07-22 17:00:52
PCR起到关键作用的是引物和酶(本质),其他优化都是治标不治本,赶紧看看引物设计的质量。或者换酶(MIX也行)

好的谢谢

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9楼2024-07-23 18:44:12
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YaVirology

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

试一试自己配一套PCR体系,加入一些DMSO和甜菜碱,具体配方论文里都有;

另外就是引物是不是太不特异了,我看杂带都很多,试着用NCBI Blast设计引物,让引物特异性高一些。
10楼2024-07-28 20:20:35
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