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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用基因组p一个3k多的片段，一直p不出来，了
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)

[求助] 用基因组p一个3k多的片段，一直p不出来，了 已有2人参与

用的高保真酶，温度从58变到55度，延伸和退火的时间和温度一直在变，p不出来，快疯了，p了几个礼拜

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1楼 2024-07-19 16:36:18
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)
用基因组p一个3k多的片段，一直p不出来，了

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2楼2024-07-19 16:40:17
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)
老是没有目的条带，应该在5000marker的第二个条带那里

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3楼2024-07-19 16:41:22
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AD_com

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
P不出来就换引物，前后多设计几对引物交叉组合使用，不要纠结于温度，温度上下差几度都没问题，再不行就去做基因合成
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4楼2024-07-20 07:16:53
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by AD_com at 2024-07-20 07:16:53
P不出来就换引物，前后多设计几对引物交叉组合使用，不要纠结于温度，温度上下差几度都没问题，再不行就去做基因合成

那可以提高胶浓度嘛

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5楼2024-07-21 07:11:19
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AD_com

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xzwlove at 2024-07-21 07:11:19
那可以提高胶浓度嘛
...

扩不出来就换引物，比摸索条件有意义，何况一件事情要是基础不好，再怎么掩饰都无济于事。
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6楼2024-07-21 15:41:40
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御风（远）

新虫 (初入文坛)
PCR起到关键作用的是引物和酶（本质），其他优化都是治标不治本，赶紧看看引物设计的质量。或者换酶（MIX也行）
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7楼2024-07-22 17:00:52
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by AD_com at 2024-07-21 15:41:40
扩不出来就换引物，比摸索条件有意义，何况一件事情要是基础不好，再怎么掩饰都无济于事。...

好吧谢谢

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8楼2024-07-23 18:43:58
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学员tll8Yk

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 御风（远） at 2024-07-22 17:00:52
PCR起到关键作用的是引物和酶（本质），其他优化都是治标不治本，赶紧看看引物设计的质量。或者换酶（MIX也行）

好的谢谢

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9楼2024-07-23 18:44:12
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YaVirology

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

试一试自己配一套PCR体系，加入一些DMSO和甜菜碱，具体配方论文里都有；

另外就是引物是不是太不特异了，我看杂带都很多，试着用NCBI Blast设计引物，让引物特异性高一些。
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10楼2024-07-28 20:20:35
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