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fanxing001

铜虫 (小有名气)

[交流] PCR出现了非目的产物

各位,我做了一个PCR反应,如图,左边1至4分别为:1、空白对照(未加细菌DNA模板);2和3都为加入细菌DNA的反应体系;4、marker。我的目的产物是2、3中1500bp的条带(较亮的),为什么包括模板在内的三个PCR反应过程都在100bp(最下面的带)左右出现了一个较暗的带?是引物形成了二聚体导致的吗?另外,3号的亮带(1500bp左右)上下都有一片较亮的地方,这些是不是我的目的产物拖出来的啊?

[ Last edited by amisking on 2009-10-20 at 11:44 ]
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bioxixi

木虫 (著名写手)

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amisking(金币+2,VIP+0): 10-20 11:44
小片段是引物二聚体,至于3号的较亮片段,我认为是你的模板,因为你是用DNA作模板的,提取过程中难以避免有些降解的小些的片段,可以少加点模板,增加循环数会好一点。没有关系,你把PCR产物切胶纯化就可以了
2楼2009-10-20 10:11:01
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fanxing001

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by bioxixi at 2009-10-20 10:11:
小片段是引物二聚体,至于3号的较亮片段,我认为是你的模板,因为你是用DNA作模板的,提取过程中难以避免有些降解的小些的片段,可以少加点模板,增加循环数会好一点。没有关系,你把PCR产物切胶纯化就可以了

谢谢您的回答。我倒是考虑过引物二聚体,但是引物二聚体最大也应该只有40bp左右,看这条带的位置大约得100bp,这是仅是由于电泳的误差造成的呗?另外,您提到增加循环数,您的意思是进一步提高目的产物的量,进而掩盖住降解的小片段的亮度吗?
3楼2009-10-20 14:53:03
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


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其实有一些拖尾对于实验没有很大的影响,因为毕竟PCR的目的产物需要纯化回收的,并且PCR的目的产物中也不仅仅是你的目的片段,还有一些像如没有得到完全延伸的片段等。
4楼2009-10-20 22:51:31
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)


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我可以担保你这种质量的PCR产物即使不纯化直接做克隆都没问题.已经很好了. 下面的确实是引物二聚体,就是那么大.托尾很正常,一点影响都没有. 用热启动酶托尾会少些,但没必要。
5楼2009-10-20 23:34:33
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yinhuali123

银虫 (小有名气)


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这个没事的,有你目的带,去凝胶回收你的片段就行了
6楼2009-10-25 21:03:39
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zhy0790707

铜虫 (初入文坛)


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若是你的图片未做任何特殊处理,这样做的效果很不错了,最下面的是引物二聚体(属正常情况),3号1500处很亮,能看到一点拖尾也很正常,毕竟不能百分之百保证DNA完整,有碎片就有拖尾
7楼2009-10-27 12:01:26
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