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求助！无缝克隆两个问题 已有2人参与
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1求助为什么无缝克隆一直都连不上啊？ 引物设计的没有问题 浓度配比也试了很多 板长都不长，不是长了菌检没有条带 2大摇完的菌液可以用小提试剂盒嘛？ 还是必须用小摇的菌 @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 [ Last edited by 想要搞科研 on 2023-9-13 at 12:29 ] |
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2楼2023-09-13 23:19:14
snoopyzxx
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【答案】应助回帖
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问题1：相信整个实验流程应该没有问题，但大概率是实验细节没有注意到，导致反复多次仍然无法成功。具体原因可能是： 1）目的片段回收后有乙醇残留：在加水洗脱前充分晾干； 2）受感受态状态影响：-80℃取出感受态应立即放在冰上融化，不要穿梭实验室； 3）同源重组后产物与感受态混合过于剧烈：在冰上轻轻吹打混匀； 4）热击后立即进行下游实验：应在冰上放置2~3分钟； 5) 菌液活化采用加了抗生素的LB培养基：热击将质粒转化至感受态，还没有进行抗性基因表达，加了抗生素后直接就把细菌杀死了，更换为无抗性的LB培养基即可； 6）LB固体平板中抗生素浓度过高：适当降低对应抗生素浓度。 问题2：大摇后的菌液是可以用小提试剂盒抽提，但是小提试剂盒柱子承载不了那么多的质粒，过饱和会导致很多质粒就浪费掉了。换言之，如果采用小提试剂盒抽提大摇菌液的话，需要将菌液进行分量提取。 |
7楼2023-09-28 08:42:00
