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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 求助！无缝克隆两个问题
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想要搞科研

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助！无缝克隆两个问题 已有2人参与

1求助为什么无缝克隆一直都连不上啊？
引物设计的没有问题
浓度配比也试了很多
板长都不长，不是长了菌检没有条带


2大摇完的菌液可以用小提试剂盒嘛？
还是必须用小摇的菌
@youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端

[ Last edited by 想要搞科研 on 2023-9-13 at 12:29 ]
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1楼 2023-09-13 11:24:53
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hlp0809

新虫 (小有名气)
我也连不上

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2楼2023-09-13 23:19:14
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你设计资料发上来看看。哪个公司的试剂？
几种可能：
1、转化不成功？做个空质粒的转化对照排除感受态和转化的问题。
2、引物设计有问题？找一个以前能做出来的无缝克隆作为阳性对照。
3、试剂有问题？

不行就做酶切连接吧。没必要死磕这个。
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生物资源交流QQ群：1044518333
3楼2023-09-15 08:34:41
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想要搞科研

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopyzxx at 2023-09-15 08:34:41
建议你设计资料发上来看看。哪个公司的试剂？
几种可能：
1、转化不成功？做个空质粒的转化对照排除感受态和转化的问题。
2、引物设计有问题？找一个以前能做出来的无缝克隆作为阳性对照。
3、试剂有问题？

...

您好，我是载体双酶切后与胶回收产物无缝克隆连不上，转化大肠板都不长是为什么呀？

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4楼2023-09-18 09:18:37
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S小金人

新虫 (初入文坛)
我也是这个问题困了好久，4500质粒片段连3900目的蛋白，一直克隆不上

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5楼2023-09-18 14:40:12
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 想要搞科研 at 2023-09-18 09:18:37
您好，我是载体双酶切后与胶回收产物无缝克隆连不上，转化大肠板都不长是为什么呀？
...

这样看不出来问题的。
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生物资源交流QQ群：1044518333
6楼2023-09-18 17:17:02
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

问题1：相信整个实验流程应该没有问题，但大概率是实验细节没有注意到，导致反复多次仍然无法成功。具体原因可能是：
1）目的片段回收后有乙醇残留：在加水洗脱前充分晾干；
2）受感受态状态影响：-80℃取出感受态应立即放在冰上融化，不要穿梭实验室；
3）同源重组后产物与感受态混合过于剧烈：在冰上轻轻吹打混匀；
4）热击后立即进行下游实验：应在冰上放置2~3分钟；
5) 菌液活化采用加了抗生素的LB培养基：热击将质粒转化至感受态，还没有进行抗性基因表达，加了抗生素后直接就把细菌杀死了，更换为无抗性的LB培养基即可；
6）LB固体平板中抗生素浓度过高：适当降低对应抗生素浓度。

问题2：大摇后的菌液是可以用小提试剂盒抽提，但是小提试剂盒柱子承载不了那么多的质粒，过饱和会导致很多质粒就浪费掉了。换言之，如果采用小提试剂盒抽提大摇菌液的话，需要将菌液进行分量提取。
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坚持到底就是胜利！
7楼2023-09-28 08:42:00
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