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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒灵敏度跑不出来
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牛腻流利

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒灵敏度跑不出来已有1人参与

合成的含病毒目的片段的质粒摇菌后提取跑QPCR，10倍倍比稀释，第一次跑第一个浓度（2*10的7次方）ct值有16；第二次第三次跑就到17~18，导致灵敏度（2*10的1次方）ct值高于38不合格。
质粒不是很稳定吗，第一次跑完了也是-20度冻存的。
第二、三次和第一次的区别就是第一次用96孔板和RNase-free水稀释质粒标曲，第二、三次用的八连管和专门的dilution稀释标曲，但是这些差别应该不是问题所在吧。
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1楼2023-05-11 16:46:05
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一点也不简单

新虫 (知名作家)
低浓度本来就不稳定，泊松分布原理

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2楼2023-05-11 18:10:32
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ffplant

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
稀释倍数是不是写错了，2*10的7次方都17.8了，怎么2*10的1次方的Ct值这么大，质粒反复冻融是会影响Ct值的变化，但如果只是冻融一次应该不会变化这么大，有可能是操作的问题，误差增大了，另外你最小浓度扩增的Ct值在38的话最好看下融解曲线是否正常，有可能都不是目的条带的扩增
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3楼2023-05-12 17:11:50
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牛腻流利

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ffplant at 2023-05-12 17:11:50
稀释倍数是不是写错了，2*10的7次方都17.8了，怎么2*10的1次方的Ct值这么大，质粒反复冻融是会影响Ct值的变化，但如果只是冻融一次应该不会变化这么大，有可能是操作的问题，误差增大了，另外你最小浓度扩增的Ct值在 ...

对啊，就是1次方的CT值太大了，没有熔解曲线，是Taqman探针法
是不是低溶度的质粒冻融一次好像就会降解了
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4楼2023-05-25 16:28:29
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打工人小欢

铁虫 (初入文坛)
反复冻熔会导致质粒降解，如果是一周内使用，放在四度完全没有问题。另外做标曲的时候，建议十倍梯度稀释，按理说，你引物探针扩增效率还行的话，10*7 cp/mL跑到16、17，10*3 cp/mL会在34-36左右，每稀释一个数量级，CT值后延3.2左右才是正常的。希望对你有帮助。

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5楼2023-06-08 15:08:23
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