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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助】cDNA一直反转录不成功。
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erictan2046

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助】cDNA一直反转录不成功。

我用的是上海生工cDNA MMLV cDNA first cDNA strand, 反转录一直不成功。
我导师给我的意见是RNA出了问题，但最近RNA一直失败，有什么更好的办法提取RNA吗？或者有什么更好的试剂盒反转录的？

大家觉得需要买太贵的试剂盒或者反转录酶么？？？我这里实验室的有一个同学她是用 Invitrogen Trizol抽提试剂，她做出来了。
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1楼 2009-09-28 10:49:34
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zdf68

新虫 (正式写手)
★
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Trizol Trizol抽提试剂
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2楼2009-09-28 11:15:37
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wlwhappy

银虫 (正式写手)
★
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反转录酶挺贵的，我们组大部分都是自己定量的。
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3楼2009-09-28 11:18:18
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
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反转录很大程度上取决于你所提的RNA质量的好坏，纯度和浓度，试剂盒提比较干净，trizol提，仔细操作，特别需要注意RNA容易降解哦
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2009-09-28 11:18:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
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提RNA最经典的试剂就是trizol啊~这东西是常规试剂吧，难道你不用这个提？
MMLV本身就是很便宜的一个酶了，一两百块根几百块的质量其实没差多少，这种酶我一般让Invitrogen公司的代理送，因为平时跟他们买很多东西
世界上最好的逆转录酶是SuperScript III，Invitrogen公司的，实在做不出来就试试吧。
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5楼2009-09-28 12:50:48
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swallow192

银虫 (小有名气)
★
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我觉得可以用异硫氰酸胍提RNA试试，我们用这种方法提取的RNA非常好，反转录效率也非常高。反转录可以不用试剂盒的，我们都是自己用oligoD（t）＋dNTP＋反转录酶自己做得。反转录酶我们用的是Invitrogen的。我觉得你作不出来可能有两个原因，1.RNA不纯，抑制反转录。2。那个反转录试剂盒里的东西有坏掉的。
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6楼2009-09-28 16:30:23
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★
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楼主最好能写明你提的样品是什么。这样大家提建议会更有针对性。
一般提RNA trizol是通用的方法，但是要注意的是现在invitrogen的trizol有很多是假的，太贪图便宜可能会吃亏的。

另外就是如果样品需要研磨一定要保证研磨过程样品中始终处于液氮的冰冻状态，如果在加trizol前样品不小心化了就会很麻烦。要严格按说明书的用量加，不能太节约
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7楼2009-09-28 19:11:41
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cc85

新虫 (初入文坛)
★
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我用的是Promega的RNA提取试剂盒，然后摸了两种方案，一种是用NEB的DNase先处理，然后用Promega的AMV进行反转录，第二种是用TOYOBO的反转录试剂盒，两种效果都很好~~
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8楼2009-09-29 16:32:47
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★
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反转之前要先检测下RNA，要是RNA有问题则重新提，
要是没问题，那就换个好点的反转酶，和RNA酶抑制剂
操作要注意，换个试验台，没准你那里被污染了。。。用乙醇喷喷
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9楼2009-09-29 16:45:37
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junliu1983

★
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我就是用Trizol抽提试剂提RNA，提得质量很好，反转用Takara的蛮好的
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10楼2009-09-29 17:57:26
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