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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教关于测序结果的问题
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士

[交流] 请教关于测序结果的问题

最近在P丝状真菌的一个基因，开始根据蛋白比对设计的简并引物，由于特异性不强P出来N多条带，测序，比对发现和其他真菌基因相似性只有39%左右。而其它真菌之间比对在47%左右。我不知道相似性达到多少才算成功。。
然后我干脆找了和该菌亲缘关系比较近的真菌直接设计了特异性引物，也是P出来N多条带，本来目标片段的长度应该是1500bp，在400bp左右有一最亮条带，回收后测序，测序结果发现和其他真菌基因相似性也只有40%
是不是我两次PCR都失败了？
郁闷死了，已经做了几个月了，不知道该怎样进行下去了，现在已经公布的该基因的全序列和我做得亲缘关系最近的只有同属于曲霉科的黑曲霉。
请求各位老师帮助。。

PS：我是直接以DNA为模板，有老师说要用mRNA,是一定要用mRNA吗？难道我从一开始就错了？

[ Last edited by yidaqunyan on 2009-9-22 at 14:36 ]
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不孝有三，读博为大！
1楼 2009-09-22 09:08:19
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yidaqunyan(金币+2,VIP+0):谢谢老师 9-22 11:27
amisking(金币+2,VIP+0): 10-9 13:21
兼并引物是否是上游从ATG开始，下游是从TGA开始？
兼并引物一般都是得到多条带，很正常啊，兼并啊，你可以设计嵌套引物，先用外侧引物进行扩增，然后再使用内侧引物扩增，经过2次兼并PCR，得到的结果就很特异了，而且两次最好都是使用Touchdown的方法，得到片段后，既可以进行genomewalking又或者RACE
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2楼2009-09-22 10:53:56
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-22 10:53:
兼并引物是否是上游从ATG开始，下游是从TGA开始？
兼并引物一般都是得到多条带，很正常啊，兼并啊，你可以设计嵌套引物，先用外侧引物进行扩增，然后再使用内侧引物扩增，经过2次兼并PCR，得到的结果就很特异了， ...

那请问老师，是不是我的两次PCR结果没有什么用啊。。。
还有，简并引物必须要从ATG开始吗？
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不孝有三，读博为大！
3楼2009-09-22 11:29:16
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
yidaqunyan(金币+2,VIP+0):谢谢老师 9-22 14:33
amisking(金币+2,VIP+0): 10-9 13:21
目标片段的长度应该是1500bp，结果在400bp左右批出条带，用这个比对意义不大，既然是同属的，基因相差应该不会很大才对。
1 可以多找几种生物，哪怕亲缘关心稍远一点也可以，比对后设计引物
2 有多条条带，建议用楼上说的巢式或半巢式PCR，可以提高特异性
3 提高PCR的退火温度
另外就是相似性39%左右，已经不低了，如果是和其他物种比对的话，要是亲缘关系很近应该会高些，也说不好
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4楼2009-09-22 13:33:32
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士
引用回帖:
Originally posted by bioxixi at 2009-9-22 13:33:
目标片段的长度应该是1500bp，结果在400bp左右批出条带，用这个比对意义不大，既然是同属的，基因相差应该不会很大才对。
1 可以多找几种生物，哪怕亲缘关心稍远一点也可以，比对后设计引物
2 有多条条带，建议 ...

谢谢老师回答，但是主要是同样的基因在其他别的两种物种，比如木霉和粗糙麦孢菌以及麦孢菌和黑曲之间相似度都是46%啊
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不孝有三，读博为大！
5楼2009-09-22 14:34:19
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xuezhen

银虫 (小有名气)
★
yidaqunyan(金币+1):谢谢参与
学习一下。
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6楼2009-09-22 14:50:05
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yidaqunyan(金币+5,VIP+0):谢谢老师的帮助，小小金币不成敬意~ 9-22 18:20
amisking(金币+3,VIP+0): 10-9 13:21
不需要从ATG开始，但是兼并引物进行扩增的片段不要太长，越长发生的错配可能就越多，请看下图为第一次扩增的结果，我是设计了2对引物，4种组合进行touchdown，模板为我要扩增物种的DNA，不使用RNA的理由是不知道我的基因在何时表达量大,
注意看图，第一张图，我PCR后各泳道呈现弥散，有一个泳道有特异性亮带，但我害怕不是我的目的条带，然后变换一端引物或两端引物进行二次扩增，就得到了很特异的FSGA1

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-22 at 19:46 ]
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7楼2009-09-22 16:25:29
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陈思容

铜虫 (正式写手)
★ ★ ★
yidaqunyan(金币+3,VIP+0):谢谢老师对我的帮助 9-22 18:20
mRNA的话，可以用qRT-PCR来检测它的时序表达，我的课题性质和你有点像！但是关于我要做的基因的表达量在什么时候最大，是从国外文献上找到的！你可以再看看相关文献！提取DNA做的话，对引物的特异性要求很高，难免不会和基因组中其他序列发生错配
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8楼2009-09-22 17:16:48
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yaoyl0679

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
yidaqunyan(金币+3,VIP+0):谢谢老师对我的帮助 9-22 18:19
简并引物扩增的时候一般不建议大于500bp的序列，容易造成错配，自己设计简并引物往往设计不好，现在有个叫做CODEHOP 的在线设计网站设计的简并引物不错，可以尝试，扩增效率比较高。另外简并引物扩增最好用touchdown优化一下
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9楼2009-09-22 17:21:36
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yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-22 16:25:
不需要从ATG开始，但是兼并引物进行扩增的片段不要太长，越长发生的错配可能就越多，请看下图为第一次扩增的结果，我是设计了2对引物，4种组合进行touchdown，模板为我要扩增物种的DNA，不使用RNA的理由是不知道我 ...

老师您请看我附件中的PCR电泳图，我是用的梯度，最右侧是marker，点样孔在最上面，marker最大为1500BP我的目的条带大概在450 左右您看我最上方的条带最清楚，但是大于1500bp，然后最下面稍微亮一点的条带应该和我的目的条带长度差不多，哪一条条带是我的目的条带呢？1500bp那个有没有可能是我的片段中间有内含子的原因呢？我的延伸时间设定了1.5min。还需要回收测序吗？
谢谢老师，不胜感激。
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不孝有三，读博为大！
10楼2009-09-22 23:08:35
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