应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教关于测序结果的问题
51/1返回列表
查看: 998  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士

[交流] 请教关于测序结果的问题

最近在P丝状真菌的一个基因，开始根据蛋白比对设计的简并引物，由于特异性不强P出来N多条带，测序，比对发现和其他真菌基因相似性只有39%左右。而其它真菌之间比对在47%左右。我不知道相似性达到多少才算成功。。
然后我干脆找了和该菌亲缘关系比较近的真菌直接设计了特异性引物，也是P出来N多条带，本来目标片段的长度应该是1500bp，在400bp左右有一最亮条带，回收后测序，测序结果发现和其他真菌基因相似性也只有40%
是不是我两次PCR都失败了？
郁闷死了，已经做了几个月了，不知道该怎样进行下去了，现在已经公布的该基因的全序列和我做得亲缘关系最近的只有同属于曲霉科的黑曲霉。
请求各位老师帮助。。

PS：我是直接以DNA为模板，有老师说要用mRNA,是一定要用mRNA吗？难道我从一开始就错了？

[ Last edited by yidaqunyan on 2009-9-22 at 14:36 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
不孝有三，读博为大！
1楼 2009-09-22 09:08:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
yidaqunyan(金币+5,VIP+0):谢谢老师的帮助，小小金币不成敬意~ 9-22 18:20
amisking(金币+3,VIP+0): 10-9 13:21
不需要从ATG开始，但是兼并引物进行扩增的片段不要太长，越长发生的错配可能就越多，请看下图为第一次扩增的结果，我是设计了2对引物，4种组合进行touchdown，模板为我要扩增物种的DNA，不使用RNA的理由是不知道我的基因在何时表达量大,
注意看图，第一张图，我PCR后各泳道呈现弥散，有一个泳道有特异性亮带，但我害怕不是我的目的条带，然后变换一端引物或两端引物进行二次扩增，就得到了很特异的FSGA1

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-22 at 19:46 ]
赞一下(21人) 回复此楼
7楼2009-09-22 16:25:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yidaqunyan(金币+2,VIP+0):谢谢老师 9-22 11:27
amisking(金币+2,VIP+0): 10-9 13:21
兼并引物是否是上游从ATG开始，下游是从TGA开始？
兼并引物一般都是得到多条带，很正常啊，兼并啊，你可以设计嵌套引物，先用外侧引物进行扩增，然后再使用内侧引物扩增，经过2次兼并PCR，得到的结果就很特异了，而且两次最好都是使用Touchdown的方法，得到片段后，既可以进行genomewalking又或者RACE
赞一下(21人) 回复此楼
2楼2009-09-22 10:53:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yidaqunyan

木虫 (正式写手)

博士
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-9-22 10:53:
兼并引物是否是上游从ATG开始，下游是从TGA开始？
兼并引物一般都是得到多条带，很正常啊，兼并啊，你可以设计嵌套引物，先用外侧引物进行扩增，然后再使用内侧引物扩增，经过2次兼并PCR，得到的结果就很特异了， ...

那请问老师，是不是我的两次PCR结果没有什么用啊。。。
还有，简并引物必须要从ATG开始吗？
赞一下 回复此楼
不孝有三，读博为大！
3楼2009-09-22 11:29:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bioxixi

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
yidaqunyan(金币+2,VIP+0):谢谢老师 9-22 14:33
amisking(金币+2,VIP+0): 10-9 13:21
目标片段的长度应该是1500bp，结果在400bp左右批出条带，用这个比对意义不大，既然是同属的，基因相差应该不会很大才对。
1 可以多找几种生物，哪怕亲缘关心稍远一点也可以，比对后设计引物
2 有多条条带，建议用楼上说的巢式或半巢式PCR，可以提高特异性
3 提高PCR的退火温度
另外就是相似性39%左右，已经不低了，如果是和其他物种比对的话，要是亲缘关系很近应该会高些，也说不好
赞一下(21人) 回复此楼
4楼2009-09-22 13:33:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 急需调剂 +7 绝不放弃22 2026-04-15 8/400 2026-04-17 23:54 by 绝不放弃22
[考研] 化工学硕294分，求导师收留 +33 yzyzx 2026-04-12 37/1850 2026-04-17 23:00 by wunaiy88
[考研] 260求调剂 +3 Zyt1314520.. 2026-04-17 4/200 2026-04-17 21:06 by Eurekall
[考研] 279求调剂 +13 张番茄不炒蛋 2026-04-11 13/650 2026-04-17 10:38 by cuisz
[考研] 材料相关专业344求调剂双非工科学校或课题组 +23 hualkop 2026-04-12 25/1250 2026-04-16 22:12 by SUSE_CL
[考研] 294求调剂 +14 淡然654321 2026-04-15 14/700 2026-04-16 21:01 by lpl364211
[考研] 求调剂推荐 +8 小聂爱学习 2026-04-14 8/400 2026-04-16 07:22 by 学员JpLReM
[考研] 通信工程求调剂！！！ +6 zlb770521 2026-04-14 6/300 2026-04-15 20:00 by 学员JpLReM
[考研] 药学求调剂 +11 RussHu 2026-04-12 13/650 2026-04-15 19:07 by zhuwenxu
[考研] 0854调剂 +13 长弓傲 2026-04-12 16/800 2026-04-15 13:45 by fenglj492
[考研] 310求调剂 +16 666真好 2026-04-11 18/900 2026-04-15 13:28 by 黑科技矿业
[考研] 材料工程281还有调剂机会吗 +43 xaw. 2026-04-11 44/2200 2026-04-15 12:46 by 西北望—风沙
[考研] 求调剂 +12 何气正 2026-04-13 13/650 2026-04-14 14:47 by zs92450
[考研] 考研求调剂 +6 ban班小七 2026-04-11 6/300 2026-04-14 14:06 by 哆啦A梦只是个梦
[考研] 105500药学求调剂 +4 x_skys 2026-04-12 4/200 2026-04-14 13:37 by rndfc
[考研] 085408光电信息工程专硕355一志愿长春光机所调剂 +6 王ymaa 2026-04-13 13/650 2026-04-14 11:33 by 王ymaa
[考研] 农学0904 312求调剂 +4 Say Never 2026-04-11 4/200 2026-04-14 09:10 by zs92450
[考研] 。 +10 李多米lee. 2026-04-12 11/550 2026-04-12 22:58 by yuyin1233
[考研] 346分，工科0854求调剂，专硕 +6 moser233 2026-04-12 7/350 2026-04-12 22:11 by fqwang
[考研] 359求调剂 +5 胃痉挛累了 2026-04-11 5/250 2026-04-11 19:55 by lbsjt
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭