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yidaqunyan木虫 (正式写手)
博士
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[交流]
请教关于测序结果的问题
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最近在P丝状真菌的一个基因，开始根据蛋白比对设计的简并引物，由于特异性不强P出来N多条带，测序，比对发现和其他真菌基因相似性只有39%左右。而其它真菌之间比对在47%左右。我不知道相似性达到多少才算成功。。 然后我干脆找了和该菌亲缘关系比较近的真菌直接设计了特异性引物，也是P出来N多条带，本来目标片段的长度应该是1500bp，在400bp左右有一最亮条带，回收后测序，测序结果发现和其他真菌基因相似性也只有40% 是不是我两次PCR都失败了？ 郁闷死了，已经做了几个月了，不知道该怎样进行下去了，现在已经公布的该基因的全序列和我做得亲缘关系最近的只有同属于曲霉科的黑曲霉。 请求各位老师帮助。。 PS：我是直接以DNA为模板，有老师说要用mRNA,是一定要用mRNA吗？难道我从一开始就错了？ [ Last edited by yidaqunyan on 2009-9-22 at 14:36 ] |
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yidaqunyan(金币+5,VIP+0):谢谢老师的帮助，小小金币不成敬意~ 9-22 18:20
amisking(金币+3,VIP+0): 10-9 13:21
yidaqunyan(金币+5,VIP+0):谢谢老师的帮助，小小金币不成敬意~ 9-22 18:20
amisking(金币+3,VIP+0): 10-9 13:21
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不需要从ATG开始，但是兼并引物进行扩增的片段不要太长，越长发生的错配可能就越多，请看下图为第一次扩增的结果，我是设计了2对引物，4种组合进行touchdown，模板为我要扩增物种的DNA，不使用RNA的理由是不知道我的基因在何时表达量大, 注意看图，第一张图，我PCR后各泳道呈现弥散，有一个泳道有特异性亮带，但我害怕不是我的目的条带，然后变换一端引物或两端引物进行二次扩增，就得到了很特异的FSGA1 [ Last edited by gastrodia on 2009-9-22 at 19:46 ] |
7楼2009-09-22 16:25:29
2楼2009-09-22 10:53:56
yidaqunyan
木虫 (正式写手)
博士
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3楼2009-09-22 11:29:16
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4楼2009-09-22 13:33:32
