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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提真菌RNA老是降解怎么回事？
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solemon23

木虫 (著名写手)

五星上将James下士

[交流] 提真菌RNA老是降解怎么回事？

准备做DDRT-PCR，用Trizol法提取RNA，完整性总是不好，找不出原因，请教各位大侠，指点一二。
提取真菌RNA，OD值如下：
260/280
1.97
1.98
1.87

260/230
1.53
1.18
1.03
电泳图片如下：
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人似秋鸿来有信，事如春梦了无痕。
1楼 2009-09-21 16:09:36
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imwjc

金虫 (小有名气)
★
solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:22
是完全按照Trizol说明书做的吗？有没有在匀浆或研磨破壁后离心呀？
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2楼2009-09-22 12:05:40
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cuizy2007

至尊木虫 (著名写手)
★
solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:22
人身体、唾液中有很多RNA酶，是不是提取的环境不够清洁，或者说话了什么的……
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3楼2009-09-22 12:55:13
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bioxixi

木虫 (著名写手)
★ ★
solemon23(金币+2,VIP+0):xiexie 1-3 23:22
偶有段时间也这样，当然我不是提真菌的，后来提好了也没找出是什么原因。。。
记得当时的转折点是加异丙醇以后，轻柔的转动，不过后来偶剧烈震荡也没有什么问题了。。。。
建议器具处理、灭菌要彻底，操作环境提前碰酒精，有条件可以用紫外照照，准备工作做好，放心大胆提就是了，你越勇敢RNase越脆弱。。。
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4楼2009-09-22 13:56:40
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zuodongyun

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
solemon23(金币+2,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
降解得很厉害，首先要确定提取RNA的仪器和试剂没有RNAase污染，研钵研棒180度烘3-4h，其他要用的东西高压灭菌3次，试剂也要用RNAasefree water 配制；其次，在研磨的时候速度要快，防止冻融后细胞的内源RNAase降解，最好在无菌工作台内进行操作
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5楼2009-09-22 18:00:33
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sunqx

木虫 (著名写手)
★
solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
真菌 含多糖很多。
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6楼2009-09-22 18:47:12
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陈思容

铜虫 (正式写手)
★
solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
降解的原因吧！条带不亮！我们实验室的师姐说TRIZOL法的提取效率不高，对于真菌来说！不如异硫酸氰胍法！
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7楼2009-09-22 19:02:56
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nhdxhjs

铁杆木虫 (正式写手)
★
solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
提取过程中有污染
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8楼2009-09-23 22:11:04
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)
★
solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
不是方法的问题，我做多，这方法还行，那可能是被降解了，器具要经DEPC浸泡，戴手套做，做完之后立即PCR,别放太久，RNA一两天就会被降解掉的。
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9楼2009-10-07 18:48:31
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