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solemon23

木虫 (著名写手)

五星上将James下士

[交流] 提真菌RNA老是降解怎么回事?

准备做DDRT-PCR,用Trizol法提取RNA,完整性总是不好,找不出原因,请教各位大侠,指点一二。
提取真菌RNA,OD值如下:
260/280
1.97
1.98
1.87

260/230
1.53
1.18
1.03
电泳图片如下:
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人似秋鸿来有信,事如春梦了无痕。
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imwjc

金虫 (小有名气)


solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:22
是完全按照Trizol说明书做的吗?有没有在匀浆或研磨破壁后离心呀?
2楼2009-09-22 12:05:40
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cuizy2007

至尊木虫 (著名写手)


solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:22
人身体、唾液中有很多RNA酶,是不是提取的环境不够清洁,或者说话了什么的……
3楼2009-09-22 12:55:13
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bioxixi

木虫 (著名写手)

★ ★
solemon23(金币+2,VIP+0):xiexie 1-3 23:22
偶有段时间也这样,当然我不是提真菌的,后来提好了也没找出是什么原因。。。
记得当时的转折点是加异丙醇以后,轻柔的转动,不过后来偶剧烈震荡也没有什么问题了。。。。
建议器具处理、灭菌要彻底,操作环境提前碰酒精,有条件可以用紫外照照,准备工作做好,放心大胆提就是了,你越勇敢RNase越脆弱。。。
4楼2009-09-22 13:56:40
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zuodongyun

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
solemon23(金币+2,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
降解得很厉害,首先要确定提取RNA的仪器和试剂没有RNAase污染,研钵研棒180度烘3-4h,其他要用的东西高压灭菌3次,试剂也要用RNAasefree water 配制;其次,在研磨的时候速度要快,防止冻融后细胞的内源RNAase降解,最好在无菌工作台内进行操作
5楼2009-09-22 18:00:33
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sunqx

木虫 (著名写手)


solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
真菌 含多糖很多。
6楼2009-09-22 18:47:12
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陈思容

铜虫 (正式写手)


solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
降解的原因吧!条带不亮!我们实验室的师姐说TRIZOL法的提取效率不高,对于真菌来说!不如异硫酸氰胍法!
7楼2009-09-22 19:02:56
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nhdxhjs

铁杆木虫 (正式写手)


solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
提取过程中有污染
8楼2009-09-23 22:11:04
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)


solemon23(金币+1,VIP+0):xiexie 1-3 23:23
不是方法的问题,我做多,这方法还行,那可能是被降解了,器具要经DEPC浸泡,戴手套做,做完之后立即PCR,别放太久,RNA一两天就会被降解掉的。
9楼2009-10-07 18:48:31
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