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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 载体构建，overlap pcr
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读书ingbs

新虫 (小有名气)

[交流] 载体构建，overlap pcr 已有2人参与

有没有大佬能解答我一个问题，
就是我想构建一个稳转载体，然后用来侵染四突，现在我这边就是想双酶切一个现有载体，得到一个带强启动子的载体，然后把目的基因和3×FLAG连起来，再和带强启动子的载体连接起来，但是现在我的基因老是扩不出来，我用的方法是overlap pcr，不知道大家有没有更好的办法，孩子快急秃了

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1楼 2022-11-26 17:41:07
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读书ingbs

新虫 (小有名气)
就是梯度pcr，退火温度啥的都试了，cDNA也是对的，但是怎么扩都扩不出来，正对照是有条带的

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2楼2022-11-26 17:42:33
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守望者047

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
目的基因多大，GC含量是多少，高GC的话要用特别的高保真Mix才能扩出来，如果不是很大建议直接合成比较划算
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数往者顺，知来者逆！
3楼2022-11-27 13:58:18
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读书ingbs

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 守望者047 at 2022-11-27 13:58:18
目的基因多大，GC含量是多少，高GC的话要用特别的高保真Mix才能扩出来，如果不是很大建议直接合成比较划算

1356bp，GC含量42.5%，直接合成太贵了，穷

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4楼2022-11-27 19:07:04
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守望者047

金虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 读书ingbs at 2022-11-27 19:07:04
1356bp，GC含量42.5%，直接合成太贵了，穷
...

1KB左右理论上P起来应该很容易得到，是完全没有条带吗？建议首先qPCR检测一下cDNA中目的基因的相对丰度，时间久了的话重新制样用Trizol提RNA再逆转一下，确保模板没问题。然后高保真酶看看启动条件是否正确，是95℃启动还是98℃启动，不行就申请个诺唯赞或者TAKARA的试用装。还有就是要用合适的引物设计辅助软件来设计引物（推荐CE designer），尽量用同源重组的方法做片段插入，能提高实验效率，祝实验顺利！
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数往者顺，知来者逆！
5楼2022-11-27 22:42:03
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BioChen

银虫 (正式写手)
★
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基因合成也没有你想象得那么贵，5毛一个碱基；新手玩overlap，折腾几个月很正常的，加油！
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6楼2022-12-02 08:54:00
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