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读书ingbs

新虫 (初入文坛)

[交流] 载体构建,overlap pcr已有2人参与

有没有大佬能解答我一个问题,
就是我想构建一个稳转载体,然后用来侵染四突,现在我这边就是想双酶切一个现有载体,得到一个带强启动子的载体,然后把目的基因和3×FLAG连起来,再和带强启动子的载体连接起来,但是现在我的基因老是扩不出来,我用的方法是overlap pcr,不知道大家有没有更好的办法,孩子快急秃了

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守望者047

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
目的基因多大,GC含量是多少,高GC的话要用特别的高保真Mix才能扩出来,如果不是很大建议直接合成比较划算
数往者顺,知来者逆!
3楼2022-11-27 13:58:18
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读书ingbs

新虫 (初入文坛)

就是梯度pcr,退火温度啥的都试了,cDNA也是对的,但是怎么扩都扩不出来,正对照是有条带的

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2楼2022-11-26 17:42:33
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读书ingbs

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 守望者047 at 2022-11-27 13:58:18
目的基因多大,GC含量是多少,高GC的话要用特别的高保真Mix才能扩出来,如果不是很大建议直接合成比较划算

1356bp,GC含量42.5%,直接合成太贵了,穷

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4楼2022-11-27 19:07:04
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守望者047

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 读书ingbs at 2022-11-27 19:07:04
1356bp,GC含量42.5%,直接合成太贵了,穷
...

1KB左右理论上P起来应该很容易得到,是完全没有条带吗?建议首先qPCR检测一下cDNA中目的基因的相对丰度,时间久了的话重新制样用Trizol提RNA再逆转一下,确保模板没问题。然后高保真酶看看启动条件是否正确,是95℃启动还是98℃启动,不行就申请个诺唯赞或者TAKARA的试用装。还有就是要用合适的引物设计辅助软件来设计引物(推荐CE designer),尽量用同源重组的方法做片段插入,能提高实验效率,祝实验顺利!
数往者顺,知来者逆!
5楼2022-11-27 22:42:03
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