应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 载体构建，overlap pcr
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 1069  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

读书ingbs

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[交流] 载体构建，overlap pcr 已有2人参与

有没有大佬能解答我一个问题，
就是我想构建一个稳转载体，然后用来侵染四突，现在我这边就是想双酶切一个现有载体，得到一个带强启动子的载体，然后把目的基因和3×FLAG连起来，再和带强启动子的载体连接起来，但是现在我的基因老是扩不出来，我用的方法是overlap pcr，不知道大家有没有更好的办法，孩子快急秃了

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2022-11-26 17:41:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

读书ingbs

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
3楼: Originally posted by 守望者047 at 2022-11-27 13:58:18
目的基因多大，GC含量是多少，高GC的话要用特别的高保真Mix才能扩出来，如果不是很大建议直接合成比较划算

1356bp，GC含量42.5%，直接合成太贵了，穷

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2022-11-27 19:07:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答

读书ingbs

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
就是梯度pcr，退火温度啥的都试了，cDNA也是对的，但是怎么扩都扩不出来，正对照是有条带的

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2022-11-26 17:42:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

守望者047

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
目的基因多大，GC含量是多少，高GC的话要用特别的高保真Mix才能扩出来，如果不是很大建议直接合成比较划算
赞一下 回复此楼
数往者顺，知来者逆！
3楼2022-11-27 13:58:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

守望者047

管理员

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 读书ingbs at 2022-11-27 19:07:04
1356bp，GC含量42.5%，直接合成太贵了，穷
...

1KB左右理论上P起来应该很容易得到，是完全没有条带吗？建议首先qPCR检测一下cDNA中目的基因的相对丰度，时间久了的话重新制样用Trizol提RNA再逆转一下，确保模板没问题。然后高保真酶看看启动条件是否正确，是95℃启动还是98℃启动，不行就申请个诺唯赞或者TAKARA的试用装。还有就是要用合适的引物设计辅助软件来设计引物（推荐CE designer），尽量用同源重组的方法做片段插入，能提高实验效率，祝实验顺利！
赞一下(2人) 回复此楼
数往者顺，知来者逆！
5楼2022-11-27 22:42:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 6 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0710生物学求调剂！ +6 叙述文 2026-03-31 6/300 2026-04-01 09:39 by JourneyLucky
[考研] 初试301，代码085701环境工程，本硕一致，四六级已过，有二区一作，共发表5篇论文 +3 axibli 2026-04-01 3/150 2026-04-01 08:43 by i_cooler
[考研] 求0861交通运输专硕or材料专硕调剂 +3 勒布朗@ 2026-03-31 3/150 2026-04-01 08:27 by JourneyLucky
[考研] 294分080500材料科学与工程求调剂 +12 柳溪边 2026-03-26 13/650 2026-04-01 01:37 by 1018329917
[考研] 070300化学专业279调剂 +10 哈哈哈^_^ 2026-03-31 10/500 2026-03-31 23:13 by liu823948201
[考研] 070300一志愿211，312分求调剂院校 +12 小黄鸭宝 2026-03-30 12/600 2026-03-31 17:53 by 544594351
[考研] 材料求调剂 一志愿哈工大总分298分，前三科223分 +11 dongfang59 2026-03-27 11/550 2026-03-31 16:51 by Wang200018
[考研] 22408 359分调剂 +4 Qshers 2026-03-27 8/400 2026-03-31 08:53 by Qshers
[考研] 085601一志愿中山大学深圳材料工程330求调剂 +5 pipiver 2026-03-30 5/250 2026-03-31 07:37 by JourneyLucky
[考研] 085600 286分 材料求调剂 +11 麻辣鱿鱼 2026-03-27 12/600 2026-03-30 19:33 by Wang200018
[考研] 求调剂 +10 家佳佳佳佳佳 2026-03-29 10/500 2026-03-30 18:34 by 544594351
[考研] 0703化学求调剂 +6 丹青奶盖 2026-03-26 8/400 2026-03-30 18:33 by 探123
[考研] 材料专硕 085600求调剂 +7 BBQ233 2026-03-30 7/350 2026-03-30 17:44 by oooqiao
[考研] 310求调剂 +10 争取九点睡 2026-03-30 10/500 2026-03-30 16:45 by ztnimte
[考研] 085600，专业课化工原理，321分求调剂 +5 大馋小子 2026-03-28 5/250 2026-03-29 08:56 by qingfeng258
[考研] 本科双非材料，跨考一志愿华电085801电气，283求调剂，任何专业都可以 +6 芝士雪baoo 2026-03-28 8/400 2026-03-29 08:16 by 松花缸1201
[考研] 286求调剂 +12 PolarBear11 2026-03-26 12/600 2026-03-28 12:14 by zllcz
[考研] 085600，材料与化工321分调剂 +4 大馋小子 2026-03-27 6/300 2026-03-27 14:11 by 松花缸1201
[考研] 调剂 +3 李嘉图·S·路 2026-03-27 3/150 2026-03-27 11:19 by wangjy2002
[考研] 打过很多竞赛，085406控制工程300分，求调剂 +3 askeladz 2026-03-26 3/150 2026-03-26 09:08 by 给你你注意休息
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭