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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 弱弱的分子生物学问题~~~~
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695

木虫 (职业作家)

[交流] 弱弱的分子生物学问题~~~~

最近遇到了两个小问题，挺起勇气在这里弱弱的和大家交流两个问题：

1。假如单引物能在PCR中扩出带来，而这个引物与已知模板序列BLAST没有结合位点，且不加模板的空白对照也无条带产生，你最先想到的可能原因是什么？该引物污染？退火温度过低？还有其他原因吗？

2. 假使某单引物能P出一条带，而且带型清晰，我能用该引物直接进行测序吗？若不能原因可能又是什么呢？

多谢了，本人基础不是很好，还望高手们轻拍！多谢大家了！
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1楼 2009-09-15 03:19:20
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HDLWH

木虫 (正式写手)
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司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 9-15 10:19
1.引物特异性差，导致非特异性扩增
2.单引物是线性扩增，产物量要小得多（双引物是指数扩增）一般测序都需要提供双引物
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2楼2009-09-15 09:59:42
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 9-15 11:15
纠正楼上一下，所有测序都是单引物测序，即使双向测也是正向测一次，反向再测一次，
单引物能扩出条带说明在模板的上下游都存在错配位点，假如Blast查不出问题的话，
按道理说不加模板的对照扩不出条带，说明扩增体系没问题，但也还有另一种可能，举例如下：

原来使用引物做RTPCR时扩出来非特异性条带，比目的条带都亮，且大，送去测序才知道是DNA污染导致的，做反转录的之前没有用DNA酶处理提取的RNA，后来处理了一下，非特异性条带不见了

[ Last edited by gastrodia on 2009-9-15 at 10:49 ]
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3楼2009-09-15 10:41:11
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liganghua

铁杆木虫 (著名写手)

露天使
★
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1.引物污染（退火温度Tm可以用公式算出，一般不会有太大问题）
2.应该可以，但确定还要看你的引物、模板是否污染
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华露花苑回廊
4楼2009-09-15 11:23:40
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heismeng

金虫 (小有名气)
★
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我真的不理解为什么sequencing反应后还要跑胶
直接测序就行了啊
还有测序引物都是单引物 哪有双引物的
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5楼2009-09-15 12:18:41
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者
测序了之后就是比较有说服力的了。pcr准确性没有测序高的啦，呵呵
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6楼2009-09-15 12:26:34
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xuezhen

银虫 (小有名气)
学习！
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7楼2009-09-15 12:44:52
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yxhan7113

金虫 (小有名气)
第一个问题两种可能，引物被污染——换新的；因为特异性不好——梯度PCR选择合适的退火温度。
单引物P出清晰条带还是特异性不好的问题，用来测序结果没有参考意义
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8楼2009-09-15 13:30:39
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695

木虫 (职业作家)
多谢楼上几位仁兄的不吝赐教！深感荣幸
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9楼2009-09-15 15:07:55
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