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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 乳酸菌表达载体构建
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guxiaofei

新虫 (小有名气)

[求助] 乳酸菌表达载体构建 已有1人参与

各位，请问pNZ8148表达载体构建有没有什么tips啊，我有两个片段要连上去，用无缝克隆构建了3个月都没连上去，已经排除酶，实验条件，载体片段（测序，但测不到同源臂啊）等原因，同一批操作阳性都有，但是实验组就是不长斑，有的要放3天才长，一菌p，结果是空载。

@天使托 发自小木虫Android客户端
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1楼 2022-09-26 15:39:55
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guxiaofei

新虫 (小有名气)
而且每次双酶切后胶回收浓度非常低，10微克的质粒，回收1微克不到，浓度从几纳克到十几纳克不等，其余胶回收浓度都是50纳克每微以上。实在是想不明白。请大神们指点！

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3楼2022-09-26 21:35:39
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
这个载体就是不好构建

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2楼2022-09-26 20:56:49
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guxiaofei

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by guxiaofei at 2022-09-26 21:35:39
而且每次双酶切后胶回收浓度非常低，10微克的质粒，回收1微克不到，浓度从几纳克到十几纳克不等，其余胶回收浓度都是50纳克每微以上。实在是想不明白。请大神们指点！
...

但是用PCR线性化做胶回收就不存在这个问题，浓度又是正常的

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4楼2022-09-26 21:53:26
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zyzhen

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

乳酸菌的质粒确实不好做，质粒可以不用做菌培，建议直接PCR直接出来线性质粒，这样胶回收的量会大，而且容易操作。
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5楼2023-10-11 15:34:26
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