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guxiaofei

新虫 (小有名气)

[求助] 乳酸菌表达载体构建 已有1人参与

各位,请问pNZ8148表达载体构建有没有什么tips啊,我有两个片段要连上去,用无缝克隆构建了3个月都没连上去,已经排除酶,实验条件,载体片段(测序,但测不到同源臂啊)等原因,同一批操作阳性都有,但是实验组就是不长斑,有的要放3天才长,一菌p,结果是空载。

@天使托 发自小木虫Android客户端
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forhighbio

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2楼2022-09-26 20:56:49
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guxiaofei

新虫 (小有名气)

而且每次双酶切后胶回收浓度非常低,10微克的质粒,回收1微克不到,浓度从几纳克到十几纳克不等,其余胶回收浓度都是50纳克每微以上。实在是想不明白。请大神们指点!

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3楼2022-09-26 21:35:39
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guxiaofei

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by guxiaofei at 2022-09-26 21:35:39
而且每次双酶切后胶回收浓度非常低,10微克的质粒,回收1微克不到,浓度从几纳克到十几纳克不等,其余胶回收浓度都是50纳克每微以上。实在是想不明白。请大神们指点!
...

但是用PCR线性化做胶回收就不存在这个问题,浓度又是正常的

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4楼2022-09-26 21:53:26
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zyzhen

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

乳酸菌的质粒确实不好做,质粒可以不用做菌培,建议直接PCR直接出来线性质粒,这样胶回收的量会大,而且容易操作。
5楼2023-10-11 15:34:26
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