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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 酶切拖带和切不开的现象
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tchv8378

新虫 (小有名气)

[求助] 酶切拖带和切不开的现象 已有2人参与

求助，我在用PCR的扩增液做单酶切，之前做的好好的没什么问题，最近发现按照之前完全相同的流程酶切切不开或者切开有拖带的现象。我开封了新的引物，新的内切酶，延长了酶切时间，减小了点样时扩增液的点样量，重新提了DNA，将buffer（10x）的含量提升到了酶切体系的1/10，酶切时间从2小时、4小时到过夜都有尝试过但还是没有达到之前的水平。

请问大佬还有其他什么原因吗？万分感谢！

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1楼 2022-09-18 13:31:26
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乌克兰跑男

铜虫 (正式写手)
换一个工程菌 我之前是验证保了两株100测序正确的 其中一株怎么切怎么换，单酶切体系都有两个条带。直到我换了另一株立马没问题了

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我思故我在
2楼2022-09-18 18:34:04
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乌克兰跑男

铜虫 (正式写手)
1.工程菌污染
2.实验室气溶胶污染~换个实验室换套枪做实验
把这些问题排除下

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我思故我在
3楼2022-09-18 18:36:06
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tchv8378

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乌克兰跑男 at 2022-09-18 18:34:04
换一个工程菌 我之前是验证保了两株100测序正确的 其中一株怎么切怎么换，单酶切体系都有两个条带。直到我换了另一株立马没问题了

谢谢回复，我这个用不到工程菌，我这个实验是提取的血液DNA扩增做酶切分型。我在网上看到其他原因可能是buffer和扩增液没有完全混合，请问在配体系时和用枪吹打几次行不行？
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4楼2022-09-18 20:51:51
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tchv8378

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 乌克兰跑男 at 2022-09-18 18:36:06
1.工程菌污染
2.实验室气溶胶污染~换个实验室换套枪做实验
把这些问题排除下

谢谢回复，我这个用不到工程菌，我这个实验是提取的血液DNA扩增做酶切分型。我换一个实验室试一下。另外我在网上看到其他原因可能是buffer和扩增液没有完全混合，请问在配体系时和用枪吹打几次行不行？
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5楼2022-09-18 21:10:49
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shuaibia6

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然之前能做的话说明体系没问题，后面的几个优化就不用做了，你有没有想过是你电泳没做好导致你认为没有切开。
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6楼2022-09-19 17:14:29
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tchv8378

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by shuaibia6 at 2022-09-19 17:14:29
既然之前能做的话说明体系没问题，后面的几个优化就不用做了，你有没有想过是你电泳没做好导致你认为没有切开。

我也是按照之前的电压和胶浓度跑的，电泳液也是新配的。下一步我想除了排除气溶胶之外，试试用3%的胶，100v电压多跑一会儿（之前用的2%的，电泳120v 45min-1h）。

链接: https://pan.baidu.com/s/1_QWukaB_V9Mav23MLQCecg 提取码: 364r
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7楼2022-09-19 17:45:06
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ap372767129

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我看了一下大家的回复，我分析应该是你的实验操作应该是没有问题的。你试试PCR完了后，切胶回收你的目的条带，溶解后再进行酶切看看。如果还是切不开，考虑一下是不是引物设计的问题，一般情况下设计的引物TM值是60，祝你成功。
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8楼2022-09-20 20:45:46
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tchv8378

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ap372767129 at 2022-09-20 20:45:46
我看了一下大家的回复，我分析应该是你的实验操作应该是没有问题的。你试试PCR完了后，切胶回收你的目的条带，溶解后再进行酶切看看。如果还是切不开，考虑一下是不是引物设计的问题，一般情况下设计的引物TM值是60 ...

好的，谢谢。设计引物的时候为了造酶切位点，前引物确实有些长（29个碱基）理论TM83.8℃，PCR程序的退火温度用60℃运行的。前期建方法的时候酶切结果经过与测序对比结果是准确的，就一直这样保留了下来。大规模检测的时候出现了条带不清晰的现象。
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9楼2022-09-20 22:34:35
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