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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建且成功表达过的重组质粒 复测数据时不表达了
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draxlx

新虫 (小有名气)

[求助] 构建且成功表达过的重组质粒 复测数据时不表达了 已有1人参与

各位大佬，诚心求助。
4月份的时候，我用无缝克隆技术构建了一个 "目的基因+耐热基因+表达载体" 的重组质粒 ，成功表达了“目的基因+耐热基因”的融合蛋白，测其酶学特性显示 ：融合蛋白比野生酶在温度稳定性方面有了极大改善。

现在7月份，我用当初保藏的菌种 再次扩培、破胞、纯化，复测其温度稳定性，发现与野生酶一样，重复不出当初的数据。
跑过菌液电泳，确实是重组质粒的菌液没有拿错。
又跑了蛋白胶，结果没有融合蛋白的表达条带，反而有野生酶的表达条带。（怪不得复测的时候，融合蛋白与野生酶的数据几乎一模一样，差别十分微小）
有没有朋友出现过这种情况啊？
（4月份所测的数据是没有错的，因为当时短时间内有3个人都测了，三个人测出来的数据是高度统一的。）
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1楼 2022-07-28 21:26:40
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爆炒小木虫

新虫 (小有名气)
是不可以保菌的，重新把质粒丢进去菌里

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2楼2022-07-29 13:03:58
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
现在是表达蛋白大小不对了，最优先的任务是重新构建质粒转化，重复之前的结果吧？
另：跑过菌液电泳，确实是重组质粒的菌液没有拿错， 这个跑的是质粒电泳，还是蛋白电泳？(如果是蛋白电泳，那应该是蛋白纯化过程中水解了；如果是质粒电泳，那蛋白在表达过程中可能就水解了）

这样的事情是怎么发生的？

可能性太多了，拿错了，污染了，linker被水解了。
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2022-07-29 16:46:09
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draxlx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pennchem at 2022-07-29 16:46:09
现在是表达蛋白大小不对了，最优先的任务是重新构建质粒转化，重复之前的结果吧？
另：跑过菌液电泳，确实是重组质粒的菌液没有拿错， 这个跑的是质粒电泳，还是蛋白电泳？(如果是蛋白电泳，那应该是蛋白纯化过程中 ...

谢谢您的回答。
已经试过将当初保存的质粒重新转化后表达，蛋白胶结果显示有融合蛋白条带出现，但是表达量非常小，且依旧有本不该出现的野生酶表达条带。
现在准备重新再构建一次质粒试试。
菌液电泳跑的是质粒电泳。我现在不明白的主要是 为什么野生酶依旧有表达呢，当初构建重组质粒的时候用的是无缝克隆，终止密码子、酶切位点等全都去掉了，将两个基因“无缝”地连在一起，如果是蛋白表达有问题，那也应该是全部不表达。
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4楼2022-07-31 13:39:34
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draxlx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爆炒小木虫 at 2022-07-29 13:03:58
是不可以保菌的，重新把质粒丢进去菌里

谢谢您的回答。已经试过将当初保存的质粒重新转化后表达，蛋白胶结果显示有融合蛋白条带出现，但是表达量非常小，且依旧有本不该出现的野生酶表达条带。现在准备重新再次去构建一次质粒试试。
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5楼2022-07-31 13:42:25
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爆炒小木虫

新虫 (小有名气)
没必要重新构载体的，每次摇菌的表达量都会不一样。要稳定的表达，直接低温诱导就好了

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6楼2022-07-31 14:21:01
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draxlx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 爆炒小木虫 at 2022-07-31 14:21:01
没必要重新构载体的，每次摇菌的表达量都会不一样。要稳定的表达，直接低温诱导就好了

理论上是这样的。但是与4月份的数据差异实在太大了，应该不单是这个原因。而且七月份我已经重复了4次了，这四次的结果是差不多的。
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7楼2022-07-31 16:09:28
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by draxlx at 2022-07-31 13:39:34
谢谢您的回答。
已经试过将当初保存的质粒重新转化后表达，蛋白胶结果显示有融合蛋白条带出现，但是表达量非常小，且依旧有本不该出现的野生酶表达条带。
现在准备重新再构建一次质粒试试。
菌液电泳跑的是质粒 ...

考虑质粒丢失，如果质粒丢失严重，则蛋白还能表达，但是表达量会大幅度下降。

或者两个菌种混在一起了，可以划平板，选单克隆，测序确认后再提质粒转化。

如果测序正确二野生酶条带依然出现，有可能是linker被水解了。
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2022-07-31 17:05:45
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