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蚝油生菜

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白表达BL21(DE3)转接后摇不起来,sds-page无天然蛋白条带 已有1人参与

在LB培养基中加入kana抗体和挑单克隆小摇的菌,过夜摇菌培养,第二天早上8.30按1:50的浓度接菌,此时过夜摇的菌od600大约1,要摇到下午3点od600才勉强到0.6左右,加iptg终浓度0.5mM,37℃200rpm诱导4h后菌液变的比未诱导对比组澄清很多,菌液中像沙石状沉淀,然后直接煮沸跑sds-page什么条带都没有,一片空白的,我这个目的蛋白是一种蛋白酶,文献中有表达过,也是用的bl21(de3),应该不是有毒蛋白的问题吧
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爆炒小木虫

新虫 (小有名气)

2楼2022-06-08 20:53:32
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ymj002

木虫 (小有名气)

应该就是蛋白毒性导致的

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3楼2022-06-08 20:55:02
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蚝油生菜

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 爆炒小木虫 at 2022-06-08 20:53:32
试一下低温诱导

不诱导的对照组也没有天然蛋白的条带诶

发自小木虫Android客户端
4楼2022-06-08 21:15:23
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蚝油生菜

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ymj002 at 2022-06-08 20:55:02
应该就是蛋白毒性导致的

但是这个蛋白的表达我参考了文献做的,完全相同的蛋白,文献中没有看出是毒性蛋白,而且也是采用的相同的宿主菌dl21(de3)表达出来了

发自小木虫Android客户端
5楼2022-06-08 21:17:38
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tangtuoxian

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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蚝油生菜: 金币+5, ★★★很有帮助 2022-06-09 11:14:26
从新挑一个单克隆菌落,过夜摇起来(10ml)。第二天提取质粒(用1-5ml,剩下的菌液保存起来),酶切之后,确定存在目的条带。
如果克隆是对的,用保存起来的菌液过夜摇起来,重复之前的蛋白表达步骤。

如果再次出现相同情况,建议用提取的质粒重新进行转化(仍然用BL21(DE3), 也可以尝试其他表达菌株)。重复上述步骤。。。
6楼2022-06-09 10:56:07
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