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蚝油生菜

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 蛋白表达BL21(DE3)转接后摇不起来，sds-page无天然蛋白条带 已有1人参与

在LB培养基中加入kana抗体和挑单克隆小摇的菌，过夜摇菌培养，第二天早上8.30按1：50的浓度接菌，此时过夜摇的菌od600大约1，要摇到下午3点od600才勉强到0.6左右，加iptg终浓度0.5mM，37℃200rpm诱导4h后菌液变的比未诱导对比组澄清很多，菌液中像沙石状沉淀，然后直接煮沸跑sds-page什么条带都没有，一片空白的，我这个目的蛋白是一种蛋白酶，文献中有表达过，也是用的bl21（de3），应该不是有毒蛋白的问题吧
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1楼 2022-06-08 20:06:34
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爆炒小木虫

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
试一下低温诱导

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2楼2022-06-08 20:53:32
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ymj002

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
应该就是蛋白毒性导致的

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3楼2022-06-08 20:55:02
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蚝油生菜

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by 爆炒小木虫 at 2022-06-08 20:53:32
试一下低温诱导

不诱导的对照组也没有天然蛋白的条带诶

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4楼2022-06-08 21:15:23
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蚝油生菜

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
3楼: Originally posted by ymj002 at 2022-06-08 20:55:02
应该就是蛋白毒性导致的

但是这个蛋白的表达我参考了文献做的，完全相同的蛋白，文献中没有看出是毒性蛋白，而且也是采用的相同的宿主菌dl21（de3）表达出来了

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5楼2022-06-08 21:17:38
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tangtuoxian

超级版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蚝油生菜: 金币+5, ★★★很有帮助 2022-06-09 11:14:26
从新挑一个单克隆菌落，过夜摇起来（10ml）。第二天提取质粒（用1-5ml，剩下的菌液保存起来），酶切之后，确定存在目的条带。
如果克隆是对的，用保存起来的菌液过夜摇起来，重复之前的蛋白表达步骤。

如果再次出现相同情况，建议用提取的质粒重新进行转化（仍然用BL21(DE3), 也可以尝试其他表达菌株）。重复上述步骤。。。
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6楼2022-06-09 10:56:07
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