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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 微米和纳米 » 学术交流 » 羧基聚苯乙烯微球表面抗体修饰
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流氓额怕水

新虫 (小有名气)

[交流] 羧基聚苯乙烯微球表面抗体修饰 已有3人参与

请问大家是怎么在微球表面进行抗体修饰的呀？我是在在MES缓冲液中加入100μl 羧基修饰的PS球，然后用EDC/NHS进行活化处理，洗球后在加入0.5mg/ml的单抗，4℃保存一夜。但是后面检测蛋白并没有信号感觉是抗体没有修饰上去，不知道有没有大佬做过类似的修饰，还请帮助
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1楼 2022-05-21 14:26:57
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zhaim1234

银虫 (小有名气)
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字面意思，4℃偶联？离心后有没有超声？没有淬灭/封闭？描述太简单，详细流程
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2楼2022-05-24 10:42:28
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流氓额怕水

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by zhaim1234 at 2022-05-24 10:42:28
字面意思，4℃偶联？离心后有没有超声？没有淬灭/封闭？描述太简单，详细流程

太谢谢你的回复。我是在加入抗体后在4℃进行偶联一夜，离心后没有进行超声，因为怕超声会把抗体破坏掉。封闭的步骤是最后加入1ml 1%BSA进行的
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3楼2022-05-24 13:45:01
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zhaim1234

银虫 (小有名气)
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一般常规抗体偶联不需要4℃，除非你的微球供应商操作手册有明确要求；每步离心后需要充分再悬浮，保证微球的分散状态，普通振荡或涡旋达不到需求，量少水浴超声分散，量多要上超声设备了，所谓破坏抗体情况多在于超声局部温度升高所致，优化超声控制，你可以控制单次超声秒数及频率和总时长，同时可以上冰浴；如果没有明确无需洗涤，活化前可能需要洗球，去除杂质及多余的表面活性剂；活化时间不易过长；MES缓冲液适合洗涤及活化，PH不适合偶联，需要按照7.4的PH基础去优化偶联缓冲液，但该PH及以上条件下羧基活化中间体不稳定，所以也就没必要过夜，37℃摇床偶联1小时左右即可，封闭后的微球保存液也一样要合适，可以维持标记物稳定
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流氓额怕水
4楼2022-05-24 15:25:46
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流氓额怕水

新虫 (小有名气)
送红花一朵
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4楼: Originally posted by zhaim1234 at 2022-05-24 15:25:46
一般常规抗体偶联不需要4℃，除非你的微球供应商操作手册有明确要求；每步离心后需要充分再悬浮，保证微球的分散状态，普通振荡或涡旋达不到需求，量少水浴超声分散，量多要上超声设备了，所谓破坏抗体情况多在于超 ...

太感谢您啦，您提到的许多细节是我没注意到的，我后面在根据这个稍微改一下我的修饰方案，然后再试一下。另外我还想问一下就是对于加入EDC/sulfo-NHS半分钟后发现羧基PS球沿着离心管壁向上分散，这是属于正常现象吗？对于EDC/NHS以及抗体的加入一般是直接用磁子边搅拌边加入，还是直接加入后振荡分散即可呢？
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5楼2022-05-24 15:50:26
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zhaim1234

银虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 流氓额怕水 at 2022-05-24 15:50:26
太感谢您啦，您提到的许多细节是我没注意到的，我后面在根据这个稍微改一下我的修饰方案，然后再试一下。另外我还想问一下就是对于加入EDC/sulfo-NHS半分钟后发现羧基PS球沿着离心管壁向上分散，这是属于正常现象吗 ...

EDC/sulfo-NHS，EDC/NHS是有区别的，我偶联前是悬浊液状态，没观察到过你说的现象，你说的现象可能是离心管壁吸附；搅拌加入在胶体金上是这么操作，微球这块我是直接加，手法问题需要自己摸索
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6楼2022-05-24 17:28:09
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流氓额怕水

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhaim1234 at 2022-05-24 17:28:09
EDC/sulfo-NHS，EDC/NHS是有区别的，我偶联前是悬浊液状态，没观察到过你说的现象，你说的现象可能是离心管壁吸附；搅拌加入在胶体金上是这么操作，微球这块我是直接加，手法问题需要自己摸索...

好的好的，我自己在试一下，谢谢您啦
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7楼2022-05-24 18:37:04
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consequently

金虫 (小有名气)

大男孩
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可以参考我的文章偶联蛋白
Analytical Chemistry  2020, 92, 17, 12088-12096
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postDocinSIAT,CAS
8楼2022-06-02 17:44:41
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卡卡blue

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by zhaim1234 at 2022-05-24 15:25:46
一般常规抗体偶联不需要4℃，除非你的微球供应商操作手册有明确要求；每步离心后需要充分再悬浮，保证微球的分散状态，普通振荡或涡旋达不到需求，量少水浴超声分散，量多要上超声设备了，所谓破坏抗体情况多在于超 ...

楼主，我想请教一下，我用多抗化学偶联羧基胶乳微球，抗体等电点5～6，微球先在MES中用EDC、NHS活化，清洗后偶联抗体：第一种：在pH6.0的100mM MES中偶联，加入抗体后发现很快就出现絮状聚集，偶联3h后超声，前几次超开过，后来做了几次一直超不开；第二种：在pH7.4的100mM PBS中偶联，加入抗体后未发现聚集，但是偶联3h后离心，发现离心不下来（离心力和清洗裸微球时用的一样大，清洗时可以离心下来）。

请问在第一种方法中出现聚集的原因是什么呢，第二种方法中为什么偶联抗体后会离心不下来？

十分困惑，非常期待您的解答！

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9楼2024-10-10 00:13:01
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