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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 救救孩子，PCR做了半年了没结果
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)

[交流] 救救孩子，PCR做了半年了没结果 已有7人参与

我首先提取螨虫体的基因组DNA，特异性扩增螨虫基因组中一段稳定遗传且保守的序列ITS2，扩增之后送PCR产物测序，然后比对测序结果得到相似度（大于90%），以这种方法来检定虫种的纯度。
      我有400个虫体样本需要检定，每次检定到100多个虫种时，扩增的条带会出现引物二聚体，然后引物二聚体越来越严重，最后目的条带消失，出现涂抹带现象。本来认为是引物降解的原因，我合成了新的引物，也没有用。提取DNA我们使用的是索莱宝的动物基因组提取试剂盒，由于螨虫极小，所以提取的浓度只有不到3ng/μl，尝试了其他的提取方式但是都没有解决。但是在实验的前100虫体都很顺利，之后条带就逐渐消失。最后我直接重新设计了引物，扩增出来的条带及其明亮单一，用以前做不出来的DNA作为模板也是单一明亮的条带。由于重新设计了引物所以400个样本的检定又要重新开始，奇怪的地方又出现了，检定了一部分时之后又出现了同样的问题。之后我又设计了第三对引物，检定了一部分时之后同样的问题又出现了。
      总之只要我重新设计引物扩增条带就很好，但是使用一段时间后就不稳定了。就算重新合成新的引物也是如此，除非重新设计新序列的引物。

救救孩子，PCR做了半年了没结果


救救孩子，PCR做了半年了没结果-1


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1楼 2022-02-23 16:17:34
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
★
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很有可能是每次扩增后电泳，导致实验室大量引物二聚体污染。

新引物可以正常扩增，但是随着电泳实验室引物二聚体越发严重，只能换新引物再来一次，如此循环。

可以考虑把出现问题的引物带到别的实验室去做，或者扩增后不电泳，放-20°C，等全部做完后，一次性电泳。
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拟南芥i
行至水穷处，坐看云起时
4楼2022-02-23 18:28:10
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shuaibia6

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的引物是用什么稀释的，有没有尝试换水源
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2楼2022-02-23 16:58:39
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liugs

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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拟南芥i
3楼2022-02-23 17:28:17
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youentea25

铜虫 (初入文坛)
★
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总觉得是模板降解了
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9楼2022-02-24 09:26:47
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shuaibia6 at 2022-02-23 16:58:39
你的引物是用什么稀释的，有没有尝试换水源

我用的是安瓿瓶里装的水无菌注射用水，一次性的，用完就丢了

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5楼2022-02-23 21:42:12
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)
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引用回帖:
3楼: Originally posted by liugs at 2022-02-23 17:28:17
是不是可以一次性扩增呢，提取完，一起将PCR做了。

我现在也有这个想法，一次性把400个样DNA全部都提取完，然后在几天之内快速的PCR，尽量的缩小战线。

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6楼2022-02-23 21:43:40
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2022-02-23 18:28:10
很有可能是每次扩增后电泳，导致实验室大量引物二聚体污染。

新引物可以正常扩增，但是随着电泳实验室引物二聚体越发严重，只能换新引物再来一次，如此循环。

可以考虑把出现问题的引物带到别的实验室去做，或 ...

这个想法我前几天也突然想到过，是不是因为我的大量pcr造成了某些污染？这些污染飘散在空中特异性的结合我的引物结合造成特异性的引物污染，只要我合成新序列的引物这种特异性的结合就会消失。因为是新的序列，这种积累还不是很强烈，所以条带又会突然的变亮。

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7楼2022-02-23 21:46:21
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shuaibia6

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼上是个不错的思路，可以先尝试。我的想法是水源污染导致产物降解但看你好像用的商品化的水应该不会有什么问题。其实引物长期使用的话用TE稀释会更好一些
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8楼2022-02-24 08:49:08
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by youentea25 at 2022-02-24 09:26:47
总觉得是模板降解了

如果是模板降解了的话，只要我重新设计引物，用以前的模板还是非常的亮和单一条带。这样一看也解释不通。

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10楼2022-02-24 10:13:41
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