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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 救救孩子，PCR做了半年了没结果
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)

[交流] 救救孩子，PCR做了半年了没结果 已有7人参与

我首先提取螨虫体的基因组DNA，特异性扩增螨虫基因组中一段稳定遗传且保守的序列ITS2，扩增之后送PCR产物测序，然后比对测序结果得到相似度（大于90%），以这种方法来检定虫种的纯度。
      我有400个虫体样本需要检定，每次检定到100多个虫种时，扩增的条带会出现引物二聚体，然后引物二聚体越来越严重，最后目的条带消失，出现涂抹带现象。本来认为是引物降解的原因，我合成了新的引物，也没有用。提取DNA我们使用的是索莱宝的动物基因组提取试剂盒，由于螨虫极小，所以提取的浓度只有不到3ng/μl，尝试了其他的提取方式但是都没有解决。但是在实验的前100虫体都很顺利，之后条带就逐渐消失。最后我直接重新设计了引物，扩增出来的条带及其明亮单一，用以前做不出来的DNA作为模板也是单一明亮的条带。由于重新设计了引物所以400个样本的检定又要重新开始，奇怪的地方又出现了，检定了一部分时之后又出现了同样的问题。之后我又设计了第三对引物，检定了一部分时之后同样的问题又出现了。
      总之只要我重新设计引物扩增条带就很好，但是使用一段时间后就不稳定了。就算重新合成新的引物也是如此，除非重新设计新序列的引物。

救救孩子，PCR做了半年了没结果


救救孩子，PCR做了半年了没结果-1


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1楼 2022-02-23 16:17:34
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拟南芥i

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by youentea25 at 2022-02-24 09:26:47
总觉得是模板降解了

如果是模板降解了的话，只要我重新设计引物，用以前的模板还是非常的亮和单一条带。这样一看也解释不通。

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10楼2022-02-24 10:13:41
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shuaibia6

金虫 (小有名气)
★
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你的引物是用什么稀释的，有没有尝试换水源
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2楼2022-02-23 16:58:39
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liugs

禁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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拟南芥i
3楼2022-02-23 17:28:17
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
很有可能是每次扩增后电泳，导致实验室大量引物二聚体污染。

新引物可以正常扩增，但是随着电泳实验室引物二聚体越发严重，只能换新引物再来一次，如此循环。

可以考虑把出现问题的引物带到别的实验室去做，或者扩增后不电泳，放-20°C，等全部做完后，一次性电泳。
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拟南芥i
行至水穷处，坐看云起时
4楼2022-02-23 18:28:10
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