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still2008至尊木虫 (著名写手)
破碎世界的守护者
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微卫星筛选——转化质粒不成功
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SSR大量扩增之后经GenClean PCR产物回收试剂盒（上海捷锐）纯化后经琼脂糖检测条带集中在300-1000之间， 载体连接体系： 总体积： 5 uL 纯化产物 2 uL PMD-18-T载体（TAKARA） 0.5 uL solution I 2.5 uL 16℃连接过夜。 转化的感受态细胞为——第一次用的是隔壁实验室自制，第二次用的是TAKARA公司，两次都长不多，一板仅有几个菌落。 问题何在，请赐教。 [ Last edited by still2008 on 2009-8-30 at 10:42 ] |
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amisking(金币+4,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-30 12:41
still2008(金币+3,VIP+0):谢谢！不过我用的DNA不是回收，用的是磁珠富集法筛选SSR，直接切基因组DNA，所以您说的杂质应该不多吧？转化用的热激。 8-30 14:00
still2008(金币+3,VIP+0):虽然还是没做出来，还是再送你几个金币，:-) 9-15 14:41
amisking(金币+4,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-30 12:41
still2008(金币+3,VIP+0):谢谢！不过我用的DNA不是回收，用的是磁珠富集法筛选SSR，直接切基因组DNA，所以您说的杂质应该不多吧？转化用的热激。 8-30 14:00
still2008(金币+3,VIP+0):虽然还是没做出来，还是再送你几个金币，:-) 9-15 14:41
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你的片段范围有点广，不妨分开来回收，300-600，600-1000这样来回收，然后分别 连接。这样计算摩尔浓度的时候相对更准确些。最后的转化不知道你是点转化还是热 激转化，可以试试你用的之外的另一种。转化后一定要用SOC摇菌一小时，不要用 LB。我的经验也就这么多了，祝好运。 落下一点，不妨扩大连接体系至10ul，因为你的切胶量肯定不少，所以你的最后 DNA片段难免会残留比较多的杂质，你的连接体系小的话，杂质浓度相对来说比较 高，可能影响连接效果。 [ Last edited by brightfuture01 on 2009-8-30 at 10:57 ] |
2楼2009-08-30 10:54:53
shenye.judy
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