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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 微卫星筛选——转化质粒不成功
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still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者

[交流] 微卫星筛选——转化质粒不成功

SSR大量扩增之后经GenClean PCR产物回收试剂盒（上海捷锐）纯化后经琼脂糖检测条带集中在300-1000之间，
              载体连接体系：
              总体积：                    5   uL
             纯化产物                      2   uL
             PMD-18-T载体（TAKARA）      0.5 uL
             solution I                                   2.5 uL
                    16℃连接过夜。

转化的感受态细胞为——第一次用的是隔壁实验室自制，第二次用的是TAKARA公司，两次都长不多，一板仅有几个菌落。


问题何在，请赐教。

[ Last edited by still2008 on 2009-8-30 at 10:42 ]
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有时一本正经，有时胡言乱语。
1楼 2009-08-30 10:39:00
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shenye.judy

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-30 12:41
still2008(金币+3,VIP+0):嗯，受教了，谢谢 8-30 14:02
still2008(金币+2,VIP+0):再送金币，都没人回帖了，哎 9-15 14:48
转化后用SOC摇菌一小时，然后离心收集细胞，有吹打菌液这步，一定要温柔，涂板子也要温柔！！！本人经验，温柔后能长出的菌落是不温柔的2倍或更多倍！！
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3楼2009-08-30 12:28:32
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+4,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-30 12:41
still2008(金币+3,VIP+0):谢谢！不过我用的DNA不是回收，用的是磁珠富集法筛选SSR，直接切基因组DNA，所以您说的杂质应该不多吧？转化用的热激。 8-30 14:00
still2008(金币+3,VIP+0):虽然还是没做出来，还是再送你几个金币，:-) 9-15 14:41
你的片段范围有点广，不妨分开来回收，300-600，600-1000这样来回收，然后分别

连接。这样计算摩尔浓度的时候相对更准确些。最后的转化不知道你是点转化还是热

激转化，可以试试你用的之外的另一种。转化后一定要用SOC摇菌一小时，不要用

LB。我的经验也就这么多了，祝好运。

落下一点，不妨扩大连接体系至10ul，因为你的切胶量肯定不少，所以你的最后

DNA片段难免会残留比较多的杂质，你的连接体系小的话，杂质浓度相对来说比较

高，可能影响连接效果。

[ Last edited by brightfuture01 on 2009-8-30 at 10:57 ]
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-30 10:54:53
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still2008

至尊木虫 (著名写手)

破碎世界的守护者
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-8-30 10:54:
你的片段范围有点广，不妨分开来回收，300-600，600-1000这样来回收，然后分别

连接。这样计算摩尔浓度的时候相对更准确些。最后的转化不知道你是点转化还是热

激转化，可以试试你用的之外的另一种。转化后 ...

热激法，LB培养基应该可用吧，实验室师兄师姐都是用的这方法，都成功了。纳闷以及郁闷中……
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有时一本正经，有时胡言乱语。
4楼2009-08-30 14:17:48
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
那你就让实验室的师兄师姐来做一次试试，呵呵，有的时候换个人也能做出来说不准

哦。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2009-08-30 17:03:31
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