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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何用乙醇沉淀酶切产物
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[交流] 如何用乙醇沉淀酶切产物

请教一下，质粒酶切后想用乙醇沉淀的方法回收DNA该如何操作？
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1楼 2009-08-28 15:58:36
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叔扬

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
huangqihong(金币+5,VIP+0):多谢！ 8-28 19:43
首先，向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc，混匀后，整个体系的Na+浓度就是0.3M（生理盐水的Na+浓度大约为0.15M）。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面，屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则的话，PO4-彼此排斥，DNA就不容易聚集。

接着，向整个体系添加2倍体积的无水乙醇。乙醇和水的互溶性很好，加进去后，乙醇就把DNA表面的水膜夺走。换句话说，水和乙醇混去了，原本溶解在水中的DNA只好被挤了出来。第一步加入的Na+平衡了PO4-的电荷，被挤出来的DNA就轻易堆积在一起了。

经过离心（12,000 rpm × 5 min），被挤出来的DNA就全部被甩到了离心管底部。把上清倒掉，剩下DNA。然而，这时的DNA不纯，还混有酶切体系留下来的盐分，以及变性了的酶。酶变性了，量也不多，不用清除。

向离心管中加入足够量的70%乙醇。这时候，既有足够的乙醇保证DNA不溶于水，又有足够的水把盐份从DNA沉淀里溶解出来。你可以选择短暂离心，或者静置1分钟，来溶解盐分。然后，去干净上清，这样剩下的DNA就不含多余的盐分等杂质，从而不会影响后续实验。

把沉淀烘干，最后用适量的水（或者TE溶液，tris保持弱碱性；EDTA螯合金属离子，抑制依赖于金属离子的DNAse；这样的DNA溶液质量更高）溶就可以了。
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小子无识
5楼2009-08-28 17:16:57
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普通回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
huangqihong(金币+5,VIP+0):谢谢了 8-28 19:42
1、将酶切产物加水稀释的一定体积（如200微升），加1/10体积3M pH5.2 NaAc。
2、等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提，离心取上清。
3、加入2.5倍体积无水乙醇，摇匀后零下20度，放置10-30分钟
4、12000rpm离心10分钟。
5、70%乙醇洗涤两次。吹干，加水溶解
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
2楼2009-08-28 17:01:09
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
离心后很可能看不到沉淀。不过并不代表没有DNA。所以最后洗涤时要特别小心！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
3楼2009-08-28 17:03:20
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huangqihong

铁虫 (小有名气)
怎么配制3M pH5.2 NaAc，用什么调pH值？-20度放置10-30分钟能完全沉淀DNA吗？4度过夜行不行？
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4楼2009-08-28 17:16:30
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695

木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 叔扬 at 2009-8-28 17:16:
首先，向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc，混匀后，整个体系的Na+浓度就是0.3M（生理盐水的Na+浓度大约为0.15M）。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面，屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则的话 ...

跟着楼上学习
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6楼2009-08-28 22:02:45
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ljy1986
7楼2009-08-28 23:06:04
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kitty8682

金虫 (正式写手)
学习了
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8楼2009-08-29 11:01:48
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zhuangyu8188

铁虫 (小有名气)
学习了
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9楼2009-08-29 11:29:01
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 叔扬 at 2009-8-28 17:16:
首先，向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc，混匀后，整个体系的Na+浓度就是0.3M（生理盐水的Na+浓度大约为0.15M）。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面，屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则的话 ...

这个好。
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生物资源交流QQ群：1044518333
10楼2009-08-29 11:33:31
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