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huangqihong铁虫 (小有名气)
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如何用乙醇沉淀酶切产物
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| 请教一下，质粒酶切后想用乙醇沉淀的方法回收DNA该如何操作？ |
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huangqihong
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4楼2009-08-28 17:16:30
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3楼2009-08-28 17:03:20
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huangqihong(金币+5,VIP+0):多谢！ 8-28 19:43
huangqihong(金币+5,VIP+0):多谢！ 8-28 19:43
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首先，向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc，混匀后，整个体系的Na+浓度就是0.3M（生理盐水的Na+浓度大约为0.15M）。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面，屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷，有利于DNA链的压缩。否则的话，PO4-彼此排斥，DNA就不容易聚集。 接着，向整个体系添加2倍体积的无水乙醇。乙醇和水的互溶性很好，加进去后，乙醇就把DNA表面的水膜夺走。换句话说，水和乙醇混去了，原本溶解在水中的DNA只好被挤了出来。第一步加入的Na+平衡了PO4-的电荷，被挤出来的DNA就轻易堆积在一起了。 经过离心（12,000 rpm × 5 min），被挤出来的DNA就全部被甩到了离心管底部。把上清倒掉，剩下DNA。然而，这时的DNA不纯，还混有酶切体系留下来的盐分，以及变性了的酶。酶变性了，量也不多，不用清除。 向离心管中加入足够量的70%乙醇。这时候，既有足够的乙醇保证DNA不溶于水，又有足够的水把盐份从DNA沉淀里溶解出来。你可以选择短暂离心，或者静置1分钟，来溶解盐分。然后，去干净上清，这样剩下的DNA就不含多余的盐分等杂质，从而不会影响后续实验。 把沉淀烘干，最后用适量的水（或者TE溶液，tris保持弱碱性；EDTA螯合金属离子，抑制依赖于金属离子的DNAse；这样的DNA溶液质量更高）溶就可以了。 |
5楼2009-08-28 17:16:57