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huangqihong

铁虫 (小有名气)

[交流] 如何用乙醇沉淀酶切产物

请教一下,质粒酶切后想用乙醇沉淀的方法回收DNA该如何操作?
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叔扬

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★
huangqihong(金币+5,VIP+0):多谢! 8-28 19:43
首先,向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc,混匀后,整个体系的Na+浓度就是0.3M(生理盐水的Na+浓度大约为0.15M)。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面,屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷,有利于DNA链的压缩。否则的话,PO4-彼此排斥,DNA就不容易聚集。

接着,向整个体系添加2倍体积的无水乙醇。乙醇和水的互溶性很好,加进去后,乙醇就把DNA表面的水膜夺走。换句话说,水和乙醇混去了,原本溶解在水中的DNA只好被挤了出来。第一步加入的Na+平衡了PO4-的电荷,被挤出来的DNA就轻易堆积在一起了。

经过离心(12,000 rpm × 5 min),被挤出来的DNA就全部被甩到了离心管底部。把上清倒掉,剩下DNA。然而,这时的DNA不纯,还混有酶切体系留下来的盐分,以及变性了的酶。酶变性了,量也不多,不用清除。

向离心管中加入足够量的70%乙醇。这时候,既有足够的乙醇保证DNA不溶于水,又有足够的水把盐份从DNA沉淀里溶解出来。你可以选择短暂离心,或者静置1分钟,来溶解盐分。然后,去干净上清,这样剩下的DNA就不含多余的盐分等杂质,从而不会影响后续实验。

把沉淀烘干,最后用适量的水(或者TE溶液,tris保持弱碱性;EDTA螯合金属离子,抑制依赖于金属离子的DNAse;这样的DNA溶液质量更高)溶就可以了。
小子无识
5楼2009-08-28 17:16:57
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★ ★
huangqihong(金币+5,VIP+0):谢谢了 8-28 19:42
1、将酶切产物加水稀释的一定体积(如200微升),加1/10体积3M pH5.2 NaAc。
2、等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,离心取上清。
3、加入2.5倍体积无水乙醇,摇匀后零下20度,放置10-30分钟
4、12000rpm离心10分钟。
5、70%乙醇洗涤两次。吹干,加水溶解
一个人可以不成功,但不可以不成长!
2楼2009-08-28 17:01:09
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

离心后很可能看不到沉淀。不过并不代表没有DNA。所以最后洗涤时要特别小心!
一个人可以不成功,但不可以不成长!
3楼2009-08-28 17:03:20
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huangqihong

铁虫 (小有名气)

怎么配制3M pH5.2 NaAc,用什么调pH值?-20度放置10-30分钟能完全沉淀DNA吗?4度过夜行不行?
4楼2009-08-28 17:16:30
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695

木虫 (职业作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 叔扬 at 2009-8-28 17:16:
首先,向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc,混匀后,整个体系的Na+浓度就是0.3M(生理盐水的Na+浓度大约为0.15M)。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面,屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷,有利于DNA链的压缩。否则的话 ...

跟着楼上学习
6楼2009-08-28 22:02:45
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7楼2009-08-28 23:06:04
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kitty8682

金虫 (正式写手)

学习了
8楼2009-08-29 11:01:48
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zhuangyu8188

铁虫 (小有名气)

学习了
9楼2009-08-29 11:29:01
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 叔扬 at 2009-8-28 17:16:
首先,向酶切体系添加1/10体积浓度为3M的NaAc,混匀后,整个体系的Na+浓度就是0.3M(生理盐水的Na+浓度大约为0.15M)。这么多的Na+均匀地分散到DNA表面,屏蔽掉DNA链上PO4-的负电荷,有利于DNA链的压缩。否则的话 ...

这个好。
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
10楼2009-08-29 11:33:31
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