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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：怎样用培养的细胞做PCR
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蝶谷医仙

新虫 (小有名气)

[交流] 求助：怎样用培养的细胞做PCR

培养了一大堆血管内皮细胞，老板说该用来做PCR了，说完就走了，老板是美国人，在下刚进实验室没几天，完全找不到北。
补充一下，我的课题大概思路是这样的，血管内皮细胞的某一段DNA序列（目前我对这段基因完全不了解）产生一种标记性蛋白，现在要检测加入某种生长因子后对产生这种蛋白有何影响。所以先培养了些血管内皮细胞，下一步我该怎么进行呢？为什么要我做PCR？其目的何在？我现在有一大堆细胞，该怎么来进行PCR？第一步是什么？恳请高手们指点，多谢啊！

[ Last edited by 350784478 on 2009-9-6 at 08:33 ]
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1楼 2009-08-25 03:30:20
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

很不同意楼上的几位！！！！

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+3,VIP+0):辛苦 8-25 14:16
这位老兄都不知道自己再干什么，你们就盲目的叫他这，叫他那！恐怕他都不知道自己什么专业出身，要是生物专业的人，你可给我们生物人“小孩他妈丢了——丢大人了！”你老板是想让你检测一下目的基因存在与否。你就提RNA就是了，应当是提取总RNA，一般没必要非得提取mRNA,这很麻烦，就光是提取mRNA看来也要你忙一阵子了，千万万要注意提取过程中那些致癌的试剂，可能你会用到DEPC（焦炭酸二乙酯），戴口罩啊，手里抱着一本冷泉港的分子指南或者精编分子指南也行。下面来自我论文中的一段东西，对你这个初学者应该有用的：2.1.3 主要菌种
大肠肝菌DHα5（缺少lacZ基因的近操纵基因区段）
2.1.4 主要试剂
RNA、DNA提取试剂：（1）0.1% DEPC-H20（2）TE3D溶液（3）饱和酚水溶液，加0.1% hydroxyquinoline（羟基喹啉）（4）氯仿/异戊醇（24/1）（5）醋酸铵（3M，高压灭菌）（6）LiCl（8mol/L）（7）无水乙醇（8）70%乙醇（9）石英砂
反转录体系试剂：M-MLV RT酶、M-MLV5×Reaction Buffer、dNTPs、OligodT、超纯水；购于Promega公司
PCR反应体系试剂：Taq酶,dNTPs，超纯水，引物，10×Buffer反应液，购自Takara公司；
蓝白斑筛选体系试剂：pMD19-T Vector、Control Insert、Insert DNA、Ligation Mix、X-gal、IPTG、AMP、双蒸水，购于Takara公司
电泳检测体系试剂：10×Loading buffer；EB, DL100Marker 购自天根（北京）科技有限公司。
培养基试剂：胰蛋白胨，酵母提取物（购自英国OXOID公司），氯化钠，琼脂(北京索莱宝科技有限公司)。
氯化钙(0.1mol/L)与其它化学试剂均为分析纯。
水：超纯去离子水，作PCR用RNase-free水。
2.1.5 主要试剂盒
DNA片段快速胶回收试剂盒购自Takara公司
pBS-TⅡ快速连接试剂盒
2.1.6 试剂配制

TE3D溶液配制：
           水                       95ml
           Tris（2M）               48.4g
           Na2EDTA（0.2M）         14.8g
           Nonidet P-40(10%)          20g
           LDS(15%)                 30g
           去氧胆酸钠（10%）        20g
           加水至200ml
氨苄青霉素（Amp 100mg/ml），购自北京鼎国生物技术有限公司。
70%的乙醇：取70ml浓度为95%的分析纯乙醇加水至95ml。
2.1.7 配制1%的琼脂糖凝胶
0.3g琼脂糖用30ml 1×电泳缓冲液，加热煮沸溶解，冷却至一定温度后加入极少量（5µl）溴化乙锭（EB）溶液。
2.1.8制备LB培养基
胰蛋白胨 （购自英国OXOID公司）      3 g
酵母提取物 （购自英国OXOID公司）    1.5 g
氯化钠                                 3 g
用蒸馏水定容至300 ml,调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存。
固体LB培养基：于500 ml液体LB液体培养基中，再加入琼脂粉5 g，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存。
一、RNA的提取：
1、配制Phenol-TE3D溶液：将一份TE3D与2份饱和酚水溶液混合，加入β-巯基乙醇（1%）备用。使用量：1.5ml/g组织。
2、取新鲜叶片约200mg，加300µl Phenol-TE3D溶液，少量石英砂，于小型研钵中迅速研磨，匀浆倒入1.5ml EP管中。以下步骤保持低温。
3、加400µl氯仿/异戊醇（2ml/g组织），250µl醋酸铵（1.25ml/g组织），涡旋1分钟，混匀。
4、4℃下离心，12000rpm，15分钟。
5、仔细取出上清（约200-250µl）至另一EP管中。
6、加入等体积LiCl，混匀，于冰盒放置1小时。
7、4℃下离心，12000rpm，30分钟。
8、DNA存在于上清液中，吸取上清液另存于另一无菌EP管备用。沉淀为RNA，用70%乙醇洗涤，4℃下离心5分钟，沉淀干燥后加入30µl水。
9、存放于-70℃备用
2.2.4反转录步骤：
一、cDNA第一条链的合成：
  1、在无RNase经过灭菌的小离心管中加入2µl RNA，0.5µl OligodT引物。用水补足15µl。
  2、70℃下水浴5分钟，打开模板的二级结构。
  3、立即冰浴阻止二级结构的再生。
  4、稍做离心，收集小管底部的溶液。
二、按顺序加入以下试剂：
  1、M-MLV5×Reaction Buffer——5µl
  2、dNTPs——5µl
  3、RNasin——25 units
  4、M-MLV反转录酶——200 units
  5、ddH2O——总体积至25µl
三、轻弹离心管，混匀试剂。42℃下水浴60min。延伸温度最适宜在37℃-42℃。
四、保存于4℃冰箱。
2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备(整个过程需无菌操作)
1）保存于-70℃的JM109菌种用接种环划菌于1.2% 琼脂平板上，37℃恒温倒置至单菌落出现（约14-16 h）。
2）挑取单菌落，接种于30 ml LB液体培养基中，37℃恒温，170 rpm振荡培养过夜（约12 h）。
3）取0.5ml过夜培养液，接种于50ml液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5 h，至OD600为0.4-0.5 h，停止培养。（此处可凭经验，用肉眼观察，菌液较浑浊）（注：以下操作均应在冰浴中进行。）
4）将全部菌液转入40 ml离心管（灭过菌的）中，每个离心管25 ml,冰上放置10 min。
5）4℃离心，2500 rpm，10 min，回收细胞。倒出培养液，将管倒置于滤纸上1 min。
6）用冰冷的CaCl2(0.1mol/L)5 ml悬浮细胞，立即放冰上保温30 min。
7）4℃离心，2000 rpm，10 min，回收细胞。
8）用冰冷的CaCl2(0.1mol/l)1 ml悬浮细胞。然后将离心管置于冰上，放4℃冰箱过夜。
9）分装感受态细胞，每只EP管中加入200 µl悬浮液和200 µl 80% 甘油，封好，然后立刻放入-70℃冰箱中保存备用。
2.2.8 PCR产物回收
PCR产物使用回收试剂盒回收，具体步骤如下：
1.使用TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收率。
3.切碎胶块。胶块切碎后可加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。
4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1µl进行计算。
5.向胶块中加入胶块融化液DR-Ⅰ Buffer，加入量如下：
凝胶浓度   DR-Ⅰ Buffer使用量
1.0%        3个凝胶体积量
6.均匀混合后75℃加热融化胶块。此时应监督振荡混合，使胶块充分融化（约6-10分钟）。
7.向上述胶块融化液中加入DR-Ⅰ Buffer量的1/2体积量DR-Ⅱ Buffer，均匀混合。
8.将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。
9.将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，12，000 rpm离心1 min，弃滤液。
10.将500μl的Rinse A加入Spin Colmun中，12，000rpm离心30 s,弃滤液。
11.将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12，000 rpm离心30 s,弃滤液。
12.重复操作步骤11。
13.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央加入25μl的Elution Buffer，室温静置1 min。
14.12，000 rpm离心1min洗脱DNA。

照我这个方法体总RNA应该没问题的。不管是动物细胞还是植物细胞应该都行的。
如果老板有相当多的钱，那就整个过程都用试剂盒好了，方便快捷，效率高。不明白的就直接给我发短消息吧，我再教你，唉，可怜的孩子呀！
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7楼2009-08-25 10:21:12
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caicaiyy

铜虫 (小有名气)

我来说一下

★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 10-7 16:54
你培养的是真核生物，应该做RT-PCR。因为真核生物基因中有内含子，不能直接PCR，即使P了，也是P处一大堆“垃圾基因”。回去学下怎样做RT-PCR。
我这里简单讲下：
1.提取细胞的总RNA，建议用trizol法。
2.立即进行反转入成CDNA。
3.从NCBI上或者基因bank上找到你要的目的蛋白的基因序列。设计引物。
4.送去公司合成引物。
5.做PCR
6.跑电泳
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16楼2009-10-07 15:43:04
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普通回帖

seabird06

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 10-7 16:53
1.提取全基因组DNA并保存，有Kit。
2.看有没有引物，做PCR是检测目的基因RNA水平在加入生长因子后有没有改变。

你实验室除了你老板不会只有你一个人了吧？
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2楼2009-08-25 06:49:47
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paulajjh

木虫 (著名写手)
建议你跟老板多交流，目的性的做实验
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3楼2009-08-25 08:37:15
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-25 14:17
引用回帖:
Originally posted by seabird06 at 2009-8-25 06:49:
1.提取全基因组DNA并保存，有Kit。
2.看有没有引物，做PCR是检测目的基因RNA水平在加入生长因子后有没有改变。

你实验室除了你老板不会只有你一个人了吧？

有点不明白，用gDNA做模版进行PCR，怎么检测RNA水平的变化？
照楼主说的实验目的，还不如提总mRNA，然后做RT-PCR......那比用细胞做原位PCR麻烦多了。
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4楼2009-08-25 09:10:55
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357601798

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第一步是提取DNA，然后从NCBI找血管内皮细胞的基因序列，根据序列设计引物。多看相关文献就会了。
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5楼2009-08-25 09:51:43
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
他的意思是让你做RT-PCR，相对定量
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6楼2009-08-25 10:01:30
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xuezhen

银虫 (小有名气)
学习下！
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8楼2009-08-25 13:40:07
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
司马诸葛(金币+2,VIP+0):奖励一下 8-25 14:17
我本科做的好像跟这个比较像，就是植物（拟南芥和菊花）响应外界刺激（声波）所做出的反应。技术用的是RT-PCR。说全了就是差异显示逆转录pcr，即DDRT-PCR。
技术路线是：提取总RNA--逆转录PCR--跑PAGE胶。通过比较刺激组和对照组（未刺激组）的DNA电泳图，观察哪些基因条带发生了变化，变多了，变少了，变没了，还是其他的变化等等。
当然，这种生物应力除了我做的声波外，还有其他的类型，包括光照、低温、高温、风等等，也包括你做的这种施加某种物质。
你可以在硕博论文数据库中，找找这方面的毕业论文。据我所知，重庆大学做生物应力做的比较多。
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生物资源交流QQ群：1044518333
9楼2009-08-25 13:54:24
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liufeng_19

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
(这位老兄都不知道自己再干什么，你们就盲目的叫他这，叫他那！恐怕他都不知道自己什么专业出身，要是生物专业的人，你可给我们生物人“小孩他妈丢了——丢大人了！”)
同意他的观点,实验前搞清导师的要求.
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10楼2009-08-25 17:37:22
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