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基因克隆的方法
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| 请教各位大侠，我要从微生物发酵中提取一种分泌蛋白，然后想克隆这种蛋白的基因，GENBank还没有报道，是不是要测这种蛋白的N和C端的氨基酸序列，然后设计兼并引物，在进行PCR，然后该怎么做呢？我是个菜鸟，新生一个，现在没有实验思路，混沌中，希望大家给予指教！！！在此谢过大家了！！！ |
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brightfuture01
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hare1212(金币+1,VIP+0): 8-23 22:33
amisking(金币+5,VIP+0):高手啊！ 8-23 22:45
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嗯，是这样的思路，呵呵。首先要纯化出这种蛋白，然后送去测定蛋白的N 端和 C端 序列，少数几个即可（因为氨基酸测序很贵的）。然后提取DNA，设计引物进行扩 增。至于基因克隆就相对简单了，首先在引物两端设计好酶切位点和保护碱基，PCR 扩增进行酶切（这步要和表达载体pET系列同时进行酶切位点的选定）。然后酶切载 体，将酶切好的PCR片段和载体进行连接。转化至DH5感受太中，挑克隆摇菌提质粒 进行酶切鉴定，鉴定为阳性克隆后将质粒转化进BL21表达宿主中，这就克隆成功了。 注意  CR扩增目的片段的时候要用 高保真酶或者与之相当的。好运 |
2楼2009-08-23 22:04:53
3楼2009-08-23 22:40:31
4楼2009-08-23 22:48:23
brightfuture01
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hare1212(金币+1,VIP+0):高手 8-24 13:04
hare1212(金币+1,VIP+0):高手 8-24 13:04
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其实并不需要知道蛋白的全序列的，因为根本用不着全部知道。只需要知道两端的数 个氨基酸的序列就可以了。长度只要够设计引物时考虑到PCR的特异性就够了。 测出两端氨基酸的序列后，比如一端测6－8个氨基酸，然后就可以有18－24bp的长 度，足矣设计引物了。因为密码子具有兼并性，所以可能一个氨基酸对应好几个密码 子，但是很多密码子的前两个核酸碱基是相同的，所以设计出来的引物一经PCR几乎 就是一条带。因为18的4次的碱基数目对于楼主用来发酵用的菌株的几个Mb的核酸 数量是远大于的。 至于楼上所说的原因之二，我个人认为工业应用没有必要知道蛋白质全序列的，只 需要根据你将来的PCR结果来反推下即可。倘若你要作定点的蛋白二级结构或者作 晶型的的话这个测序是必要的。 我最近刚看到小日本发在AEM上的一篇关于metaproteomics的文献就是这样作的， 没问题的。 祝好运 [ Last edited by brightfuture01 on 2009-8-24 at 00:21 ] |
5楼2009-08-24 00:17:38
brightfuture01
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hare1212(金币+1,VIP+0):谢谢指教！能加你的QQ么？以便日后请教！ 8-24 13:07
hare1212(金币+1,VIP+0):谢谢指教！能加你的QQ么？以便日后请教！ 8-24 13:07
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蛋白的纯化可以用SDS-PAGE或者2D，然后把你的目的蛋白那块胶挖下来，再洗脱 到溶液中，只要很少量就够测序用了。还有什么疑问的话先找个测序公司问问他们 的蛋白测序时这样的操作能不能用于测序。 等你做到那步你就不会问这样的问题了，因为你就一条氨基酸序列设计简并引物 那还不是简单的要命。先不要假设你的PCR有多条带，  ，一切等你测序完了就知道后面是多么简单了。 [ Last edited by brightfuture01 on 2009-8-24 at 00:33 ] |
6楼2009-08-24 00:24:41
zhaocy8903
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