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基因克隆的方法
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| 请教各位大侠，我要从微生物发酵中提取一种分泌蛋白，然后想克隆这种蛋白的基因，GENBank还没有报道，是不是要测这种蛋白的N和C端的氨基酸序列，然后设计兼并引物，在进行PCR，然后该怎么做呢？我是个菜鸟，新生一个，现在没有实验思路，混沌中，希望大家给予指教！！！在此谢过大家了！！！ |
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zhaocy8903
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7楼2009-08-24 08:12:05
brightfuture01
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hare1212(金币+1,VIP+0): 8-23 22:33
amisking(金币+5,VIP+0):高手啊！ 8-23 22:45
hare1212(金币+1,VIP+0): 8-23 22:33
amisking(金币+5,VIP+0):高手啊！ 8-23 22:45
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嗯，是这样的思路，呵呵。首先要纯化出这种蛋白，然后送去测定蛋白的N 端和 C端 序列，少数几个即可（因为氨基酸测序很贵的）。然后提取DNA，设计引物进行扩 增。至于基因克隆就相对简单了，首先在引物两端设计好酶切位点和保护碱基，PCR 扩增进行酶切（这步要和表达载体pET系列同时进行酶切位点的选定）。然后酶切载 体，将酶切好的PCR片段和载体进行连接。转化至DH5感受太中，挑克隆摇菌提质粒 进行酶切鉴定，鉴定为阳性克隆后将质粒转化进BL21表达宿主中，这就克隆成功了。 注意  CR扩增目的片段的时候要用 高保真酶或者与之相当的。好运 |
2楼2009-08-23 22:04:53
3楼2009-08-23 22:40:31
4楼2009-08-23 22:48:23