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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 基因克隆的方法
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hare1212

金虫 (小有名气)

[交流] 基因克隆的方法

请教各位大侠，我要从微生物发酵中提取一种分泌蛋白，然后想克隆这种蛋白的基因，GENBank还没有报道，是不是要测这种蛋白的N和C端的氨基酸序列，然后设计兼并引物，在进行PCR，然后该怎么做呢？我是个菜鸟，新生一个，现在没有实验思路，混沌中，希望大家给予指教！！！在此谢过大家了！！！
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1楼 2009-08-23 21:26:47
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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★ ★ ★ ★ ★ ★
hare1212(金币+1,VIP+0): 8-23 22:33
amisking(金币+5,VIP+0):高手啊！ 8-23 22:45
嗯，是这样的思路，呵呵。首先要纯化出这种蛋白，然后送去测定蛋白的N 端和 C端

序列，少数几个即可（因为氨基酸测序很贵的）。然后提取DNA，设计引物进行扩

增。至于基因克隆就相对简单了，首先在引物两端设计好酶切位点和保护碱基，PCR

扩增进行酶切（这步要和表达载体pET系列同时进行酶切位点的选定）。然后酶切载

体，将酶切好的PCR片段和载体进行连接。转化至DH5感受太中，挑克隆摇菌提质粒

进行酶切鉴定，鉴定为阳性克隆后将质粒转化进BL21表达宿主中，这就克隆成功了。

注意CR扩增目的片段的时候要用 高保真酶或者与之相当的。

好运
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2楼2009-08-23 22:04:53
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hare1212

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2009-8-23 22:04:
嗯，是这样的思路，呵呵。首先要纯化出这种蛋白，然后送去测定蛋白的N 端和 C端

序列，少数几个即可（因为氨基酸测序很贵的）。然后提取DNA，设计引物进行扩

增。至于基因克隆就相对简单了，首先在引物两端 ...

再请教大侠，纯化的蛋白要多纯才能用于测定N 端和 C端？如何设计简并引物呢？如果PCR出来不只有一条电泳条带该如何分析哪条是我要的产物呢？谢谢大侠的指导！！！
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3楼2009-08-23 22:40:31
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anik

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
hare1212(金币+1,VIP+0):谢谢回答 8-23 22:55
amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-24 08:23
楼上的还不尽然。
首先是分离这个蛋白：双向电泳或者SDS-PAGE分离，然后发质谱。这个最好是全打了，贵些但不在乎花这些钱，此原因之一，之二：你当然是要知道这个蛋白的全序列了。
打完质谱也就知道了全序列，设计兼并引物，以基因组DNA为模板进行PCR，切胶回收并连接----〉转化----〉挑选单克隆培养，然后测序，即可知道此蛋白的基因序列，最后是翻译然后比对验证。
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4楼2009-08-23 22:48:23
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brightfuture01

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★
hare1212(金币+1,VIP+0):高手 8-24 13:04
其实并不需要知道蛋白的全序列的，因为根本用不着全部知道。只需要知道两端的数

个氨基酸的序列就可以了。长度只要够设计引物时考虑到PCR的特异性就够了。

测出两端氨基酸的序列后，比如一端测6－8个氨基酸，然后就可以有18－24bp的长

度，足矣设计引物了。因为密码子具有兼并性，所以可能一个氨基酸对应好几个密码

子，但是很多密码子的前两个核酸碱基是相同的，所以设计出来的引物一经PCR几乎

就是一条带。因为18的4次的碱基数目对于楼主用来发酵用的菌株的几个Mb的核酸

数量是远大于的。

至于楼上所说的原因之二，我个人认为工业应用没有必要知道蛋白质全序列的，只

需要根据你将来的PCR结果来反推下即可。倘若你要作定点的蛋白二级结构或者作

晶型的的话这个测序是必要的。

我最近刚看到小日本发在AEM上的一篇关于metaproteomics的文献就是这样作的，

没问题的。

祝好运

[ Last edited by brightfuture01 on 2009-8-24 at 00:21 ]
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5楼2009-08-24 00:17:38
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brightfuture01

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★
hare1212(金币+1,VIP+0):谢谢指教！能加你的QQ么？以便日后请教！ 8-24 13:07
引用回帖:
Originally posted by hare1212 at 2009-8-23 22:40:

再请教大侠，纯化的蛋白要多纯才能用于测定N 端和 C端？如何设计简并引物呢？如果PCR出来不只有一条电泳条带该如何分析哪条是我要的产物呢？谢谢大侠的指导！！！

蛋白的纯化可以用SDS-PAGE或者2D，然后把你的目的蛋白那块胶挖下来，再洗脱

到溶液中，只要很少量就够测序用了。还有什么疑问的话先找个测序公司问问他们

的蛋白测序时这样的操作能不能用于测序。

等你做到那步你就不会问这样的问题了，因为你就一条氨基酸序列设计简并引物

那还不是简单的要命。先不要假设你的PCR有多条带，，一切等你测序完了就

知道后面是多么简单了。

[ Last edited by brightfuture01 on 2009-8-24 at 00:33 ]
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6楼2009-08-24 00:24:41
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
hare1212(金币+1,VIP+0):谢谢！ 8-24 13:08
C端测10个氨基酸好像不太可能吧
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7楼2009-08-24 08:12:05
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anik

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
6楼，人家不是工业方面的应用！！！
如果做一个蛋白，连它的序列都不测全的话，对这个基因来说是不完整的！
且不说他的其他的作用，就单单对你的论文来说就很需要！
做分子，还心疼那几个钱么？
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8楼2009-08-25 22:00:54
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