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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 用cDNA做模板PCR扩不出来……
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spiderboy

金虫 (正式写手)

[交流] 用cDNA做模板PCR扩不出来……

我用cDNA做模板扩1.4K和2.6K的片段，扩了很多次都扩不出来。。
退火温度用过55度和50度。。。
请问是哪出了问题。。
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1楼2009-08-22 20:40:11
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-22 20:54
自我感觉cDNA质量怎么样？

可以试试多重PCR，有可能你第一次P出来的量太少，跑电泳基本上看不到条带。

将PCR结果做个稀释比如1X 10X ，取1ul为模板再PCR。

或者你可以试试touchdown PCR ，我PCR不出东西的时候，最先都是用这两种方法重

新PCR，往往能够奏效。

祝好运。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2009-08-22 20:48:04
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spiderboy

金虫 (正式写手)
谢谢！对于楼上你说的第一个方法，因模板少，第二次扩的时候还要再稀释吗？
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3楼2009-08-22 21:50:16
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fishing2939

新虫 (初入文坛)
★
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要稀释的
建议验证一下模板
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4楼2009-08-22 22:16:20
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
★
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amisking(金币+0,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-23 13:16
引用回帖:
Originally posted by spiderboy at 2009-8-22 21:50:
谢谢！对于楼上你说的第一个方法，因模板少，第二次扩的时候还要再稀释吗？

同时作几个梯度的PCR

只需要第一次PCR产物 2ul 就够了。

第一个PCR为1ul为模板，第二个为剩下的1ul稀释10倍 100倍 后各取1ul为模板。

祝好运。
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5楼2009-08-23 00:39:43
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小瞥

铁虫 (小有名气)
一般cDNA 要稀释，还有，你的目的片段挺大的，不行要降低退火温度
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6楼2009-08-23 13:06:13
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tancf

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-26 19:06
PCR没有结果，很多因素是要考虑的。
你觉得你的模板怎么样呢i？如果不敢肯定的话，不妨先去测序看看。
引物也是比较关键的，重新用软件核对一下，看看有没有大问题。
对于PCR体系，要注意各个组分的量的范围，这个你可以查查PCR的技术方面的说明，它会告诉你各个组分的量的范围。
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7楼2009-08-23 14:07:00
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spiderboy

金虫 (正式写手)
谢谢楼上的各位，实验仍在尝试中
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8楼2009-08-26 18:59:44
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gogen

金虫 (小有名气)
;cDNA P不出来有可能是摸板纯度问题~~换个酶试试?
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9楼2009-08-26 23:40:29
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