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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 克隆测序总是有突变点
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baiyidao

金虫 (小有名气)

[交流] 克隆测序总是有突变点

最近做克隆测序，用载体pMD19-T Simple Vector和大肠杆菌JM109，每次测序后有突变点，修复后筛选阳性克隆子，测序有在其他的地方出现突变点，这是什么原因引起的呢，请高手指教，帮忙分析一下。Sample TextSample Text
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1楼 2009-08-10 21:14:41
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU
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amisking(金币+3,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-10 22:16
以前我也碰到过，我那个的缺失影响ORF的，主要在引物的下游一段，而且几次的缺失还是不一样的，后来一怒之下挑了10多个一起去测序，还好有一个是正确的，比较头疼。我当时怀疑：1.模板问题，杂质影响了PCR；2.pcr体系问题，不稳定；3.实验的操作污染;4.pcr仪器不行；5.PCR本身就有千分之零点多的误差允许，就咱碰到了；6.基因中个别碱基本来就是缺失的可能性也是有的。7.测序错误（当时我送的是上海生工）。
楼主再试试，dna/rna提取纯化下，优化一下克隆方法，注意实验的操作，再测一下，应该没有问题。
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活着就要让人感受到你的存在。
3楼2009-08-10 22:07:38
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普通回帖

qgaoamtf

至尊木虫 (职业作家)
测序误差？
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2楼2009-08-10 21:48:57
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lihaoexe

银虫 (小有名气)
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我也碰到了，而且两次突变点都一摸一样！郁闷
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4楼2009-08-10 22:59:09
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huiee

金虫 (正式写手)
PCR有突变的很正常的吧
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5楼2009-08-11 02:30:40
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
★
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不是用高保真酶的话突变很正常，但是在菌体内克隆很少突变，因为菌体内都有修复突变的机制
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6楼2009-08-11 03:30:58
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zhangf323

新虫 (初入文坛)
★
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这应该是误差，很正常。可能是酶的原因，也可能是测序的时候造成的，但是有个办法可以避免。就是测序时多测几个样品。如果每个样品都在同一个位置发生同样的突变，那么这就是你的插入序列本身的突变，否则，就是测序过程造成的，这很正常。
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7楼2009-08-11 14:46:02
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pqw1234

新虫 (初入文坛)
★
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我们实验室也多次遇到过这种情况，很头疼。后来我们改用了Transgene的一种pfu和Taq混合的酶来扩增，保真度很高，你可以去问问看！！本人不是托，用过了解决了这个问题，给你提个建议。
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微生物
8楼2009-08-13 10:49:38
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panacea007

银虫 (小有名气)
★
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换个酶试试。

platinum + pfu, 兼顾保真性 和 扩增效率， 二者添加比例 20比1    10 比1也行。

其它还有很多公司的酶都可以嘛。

这个突变就是个概率事件了，有时候就遇上了。。。
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9楼2009-08-13 12:53:30
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antibody01

金虫 (著名写手)
正常吧
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生活就像强奸，无法反抗就要学会享受； 工作就像轮奸，你不行就要别人上； 社会就像自慰，一切都要靠自己的双手解决。
10楼2009-08-13 13:06:25
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