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求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？已有1人参与
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本人初入分子生物，用PPIZCA质粒重组了阿魏酸酯酶的基因序列，然后我把重组质粒导入毕赤酵母中。结果是，PCR和测序验证基因大小和序列没问题，western blot也做了能看到所在处清晰的条带，但是有一次出现了包涵体，这一次没有，我用这一次的粗酶液和提纯的蛋白测试酶活性，结果一点活性没有。请教大佬帮我分析一下可能的原因和解决办法。 @gyesang @hc-material 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2021-03-28 11:07:24
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3楼2021-03-28 12:48:27
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4楼2021-03-28 22:42:20
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5楼2021-03-28 22:43:01
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嗯嗯，我的是胞内表达，用的200w，10s超声，10s停止，一共20min的超声条件，加了ripa和pi，我这个是水解酶，不知道是我在提的过程中失活了。对了，我的粗酶液酶活检测，是我50毫升培养液取了100微升的上清做的活性检测，这个量是有些少了吗？一般需要富集粗酶液吗？ 发自小木虫Android客户端 |
6楼2021-03-30 14:18:56
7楼2021-03-30 14:21:03
8楼2021-03-30 14:21:59
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可溶提纯的，我有histag标签我用的亲和层析法提纯的。我的基因序列对，电泳分子大小也对，蛋白条带也对，就是酶活没有。这个你碰到过吗？还是我酶活检测的样品太少了吗？或者中间被我弄失活了？ 发自小木虫Android客户端 |
9楼2021-03-30 14:24:29
snoopyzxx
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10楼2021-03-30 20:02:07
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