应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？
132/2返回列表上一页12
查看: 2910  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者Ma丶lone将赠送您 30 个金币

Ma丶lone

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-03-30 20:02:07
没看懂。粗酶液是破菌后取得上清测得，还是发酵液上清？
...

我都测了，摇完菌体得上清，取了100微升测得酶活，没有。菌体重悬破碎，离心得上清，取了100微升测得酶活，也没有。就是胞内酶液和胞外酶液我都测了，没有。我准备重复一次。但是也想看看其他的问题，是不是我破碎的方式有问题导致酶失活了，或者是我用来测活性的量太少了。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
11楼2021-03-30 21:52:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zsygxh

金虫 (小有名气)
首先，可溶不一定是结构正确的单体，也可能是可溶性多聚体，这是很常见的。你的蛋白出现过包涵体，说明蛋白容易聚集，你首先要想办法搞清楚是什么原因导致的。我看了几种不同的序列，预测分析发现它们的共同特征是本身较稳定，热稳定性也比较好，但含有较多的Cys。尽管酵母能辅助二硫键形成，但多Cys正确配对还是有一定困难的（虽然不知道你具体是哪个序列）。所以，我个人认为聚集可能主要是由于分子内以及分子间的二硫键错配造成的。建议破菌纯化后做还原非还原电泳比较，看一下非还原电泳是否存在大量二聚、三聚等多聚体。如果是这种情况，要么优化表达，要么对样品复性，比如破菌加还原剂，直接还原纯化，纯化后稀释蛋白，在较低的浓度下低温透析缓慢去除还原剂让其逐渐氧化，也可以添加GSH、GSSG来辅助体外二硫键的形成。如果有分子筛，可以把纯化的样品还原处理以后再跑一下柱子（buffer带盐），看一下还原以后是否存在多聚体，如果有明显聚集体，说明存在较明显的疏水聚集。这时候就需要用尿素或盐酸胍对样品变性并还原处理，然后再尝试复性。
另外，超声一般建议冰浴超2s停3s，超10s容易导致过热引发蛋白变性聚集，功率根据体积来决定，看一下仪器的说明书。
赞一下 回复此楼
12楼2021-04-09 14:13:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

科研检测交流

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你试试这里问一下,有老师免费解答,平时找文献也可以,都很方便
求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？
赞一下 回复此楼
13楼2025-08-19 12:08:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Ma丶lone 的主题更新
132/2返回列表上一页12
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +6 Isak0320 2026-10-12 9/450 2026-10-12 21:13 by Isak0320
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +6 13108017953 2026-10-08 6/300 2026-10-12 20:07 by w3w3y3
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +4 wangyl_123 2026-10-10 8/400 2026-10-12 18:09 by wangyl_123
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +3 好运来～9527 2026-10-10 6/300 2026-10-12 14:55 by 简单化xn
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭