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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

10楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-03-30 20:02:07
没看懂。粗酶液是破菌后取得上清测得，还是发酵液上清？
...

我都测了，摇完菌体得上清，取了100微升测得酶活，没有。菌体重悬破碎，离心得上清，取了100微升测得酶活，也没有。就是胞内酶液和胞外酶液我都测了，没有。我准备重复一次。但是也想看看其他的问题，是不是我破碎的方式有问题导致酶失活了，或者是我用来测活性的量太少了。

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11楼2021-03-30 21:52:44

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zsygxh

金虫 (小有名气)

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首先，可溶不一定是结构正确的单体，也可能是可溶性多聚体，这是很常见的。你的蛋白出现过包涵体，说明蛋白容易聚集，你首先要想办法搞清楚是什么原因导致的。我看了几种不同的序列，预测分析发现它们的共同特征是本身较稳定，热稳定性也比较好，但含有较多的Cys。尽管酵母能辅助二硫键形成，但多Cys正确配对还是有一定困难的（虽然不知道你具体是哪个序列）。所以，我个人认为聚集可能主要是由于分子内以及分子间的二硫键错配造成的。建议破菌纯化后做还原非还原电泳比较，看一下非还原电泳是否存在大量二聚、三聚等多聚体。如果是这种情况，要么优化表达，要么对样品复性，比如破菌加还原剂，直接还原纯化，纯化后稀释蛋白，在较低的浓度下低温透析缓慢去除还原剂让其逐渐氧化，也可以添加GSH、GSSG来辅助体外二硫键的形成。如果有分子筛，可以把纯化的样品还原处理以后再跑一下柱子（buffer带盐），看一下还原以后是否存在多聚体，如果有明显聚集体，说明存在较明显的疏水聚集。这时候就需要用尿素或盐酸胍对样品变性并还原处理，然后再尝试复性。
另外，超声一般建议冰浴超2s停3s，超10s容易导致过热引发蛋白变性聚集，功率根据体积来决定，看一下仪器的说明书。

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12楼2021-04-09 14:13:39

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