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[求助]
求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？ 已有2人参与
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本人初入分子生物，用PPIZCA质粒重组了阿魏酸酯酶的基因序列，然后我把重组质粒导入毕赤酵母中。结果是，PCR和测序验证基因大小和序列没问题，western blot也做了能看到所在处清晰的条带，但是有一次出现了包涵体，这一次没有，我用这一次的粗酶液和提纯的蛋白测试酶活性，结果一点活性没有。请教大佬帮我分析一下可能的原因和解决办法。 @gyesang @hc-material 发自小木虫Android客户端 |
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zsygxh
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首先，可溶不一定是结构正确的单体，也可能是可溶性多聚体，这是很常见的。你的蛋白出现过包涵体，说明蛋白容易聚集，你首先要想办法搞清楚是什么原因导致的。我看了几种不同的序列，预测分析发现它们的共同特征是本身较稳定，热稳定性也比较好，但含有较多的Cys。尽管酵母能辅助二硫键形成，但多Cys正确配对还是有一定困难的（虽然不知道你具体是哪个序列）。所以，我个人认为聚集可能主要是由于分子内以及分子间的二硫键错配造成的。建议破菌纯化后做还原非还原电泳比较，看一下非还原电泳是否存在大量二聚、三聚等多聚体。如果是这种情况，要么优化表达，要么对样品复性，比如破菌加还原剂，直接还原纯化，纯化后稀释蛋白，在较低的浓度下低温透析缓慢去除还原剂让其逐渐氧化，也可以添加GSH、GSSG来辅助体外二硫键的形成。如果有分子筛，可以把纯化的样品还原处理以后再跑一下柱子（buffer带盐），看一下还原以后是否存在多聚体，如果有明显聚集体，说明存在较明显的疏水聚集。这时候就需要用尿素或盐酸胍对样品变性并还原处理，然后再尝试复性。 另外，超声一般建议冰浴超2s停3s，超10s容易导致过热引发蛋白变性聚集，功率根据体积来决定，看一下仪器的说明书。 |
12楼2021-04-09 14:13:39
forhighbio 
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4楼2021-03-28 22:42:20
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