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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助,毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶,蛋白没有活性,可能哪些问题,该怎么解决现状? 已有2人参与

本人初入分子生物,用PPIZCA质粒重组了阿魏酸酯酶的基因序列,然后我把重组质粒导入毕赤酵母中。结果是,PCR和测序验证基因大小和序列没问题,western blot也做了能看到所在处清晰的条带,但是有一次出现了包涵体,这一次没有,我用这一次的粗酶液和提纯的蛋白测试酶活性,结果一点活性没有。请教大佬帮我分析一下可能的原因和解决办法。

@gyesang @hc-material 发自小木虫Android客户端
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by Ma丶lone at 2021-03-30 14:18:56
嗯嗯,我的是胞内表达,用的200w,10s超声,10s停止,一共20min的超声条件,加了ripa和pi,我这个是水解酶,不知道是我在提的过程中失活了。对了,我的粗酶液酶活检测,是我50毫升培养液取了100微升的上清做的活性 ...

没看懂。粗酶液是破菌后取得上清测得,还是发酵液上清?

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VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
10楼2021-03-30 20:02:07
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查看全部 13 个回答

forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)


基因序列没问题吧,如果是专利里面拷贝的序列,可要担心呢

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2楼2021-03-28 11:07:24
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
提纯蛋白是包涵体纯化出来的还是可溶纯化出来的?
如果是包涵体纯化的话,有时候虽然能纯化出来可以溶解,但是其实是不正确折叠的没有活性
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2021-03-28 12:48:27
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

酵母表达怎么会出现包涵体呢?概率极低。

发自小木虫Android客户端
VX:19192310212;公众号:生物技术与IVD
4楼2021-03-28 22:42:20
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