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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？
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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？ 已有2人参与

本人初入分子生物，用PPIZCA质粒重组了阿魏酸酯酶的基因序列，然后我把重组质粒导入毕赤酵母中。结果是，PCR和测序验证基因大小和序列没问题，western blot也做了能看到所在处清晰的条带，但是有一次出现了包涵体，这一次没有，我用这一次的粗酶液和提纯的蛋白测试酶活性，结果一点活性没有。请教大佬帮我分析一下可能的原因和解决办法。

@gyesang @hc-material 发自小木虫Android客户端
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1楼 2021-03-28 08:03:44
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Ma丶lone at 2021-03-30 14:18:56
嗯嗯，我的是胞内表达，用的200w，10s超声，10s停止，一共20min的超声条件，加了ripa和pi，我这个是水解酶，不知道是我在提的过程中失活了。对了，我的粗酶液酶活检测，是我50毫升培养液取了100微升的上清做的活性 ...

没看懂。粗酶液是破菌后取得上清测得，还是发酵液上清？

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10楼2021-03-30 20:02:07
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
基因序列没问题吧，如果是专利里面拷贝的序列，可要担心呢

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2楼2021-03-28 11:07:24
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提纯蛋白是包涵体纯化出来的还是可溶纯化出来的？
如果是包涵体纯化的话，有时候虽然能纯化出来可以溶解，但是其实是不正确折叠的没有活性
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2021-03-28 12:48:27
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
酵母表达怎么会出现包涵体呢？概率极低。

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4楼2021-03-28 22:42:20
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