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救命！载体构建！
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大家好啊！小弟在这里请教大家一个问题。 我在做载体构建，将一个1700bp的片段连接到pCAMBIA1301上，首先PCR得到1700bp的插入片段，在该片段的两端分别有Kpn I与BamH I酶切位点。片段与载体用这两种酶双酶切后，用T4 DNA连接酶（TAKARA）连接。可是一直都没有链接成功。我开始时是同时双酶切的，后来改成分步酶切。但同样没有连接上。 后来我PCR后直接将PCR产物与pMD18-T 载体连接，同样连接效率很差。挑取了15个担菌落只有1个是连接上的，但连接方向是反向的。我用Kpn I 与BamH I 分步酶切后于pCAMBIA1301连接，转化后没有长出菌来。 我做了很长时间了，各种方法都试啦，都不成功。小弟都没有继续做下去的勇气啦。还望哪位仁兄给指点一下。不胜感激！ |
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